聯(lián)系電話
杭州實了個驗生物科技有限公司
中級會員·2年
- 聯(lián)系人：
- 王志文
- 電話：
- 0571-86288209
- 手機：
- 13158823830
- 地址：
- 杭州市下城區(qū)金通數(shù)字經(jīng)濟科創(chuàng)園8幢2樓
- 個性化：
- www.shilegeyan.cn
- 網(wǎng)址：
- www.shilegeyan.cn
掃一掃訪問手機商鋪
提 供 商
資料大小
資料類型
資料圖片
下載次數(shù)
瀏覽次數(shù)使用賽默飛實時熒光定量PCR儀測定Tm值的原理與應(yīng)用
一、引言
聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種廣泛應(yīng)用于分子生物學,、醫(yī)學診斷,、食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域的核酸擴增技術(shù)。實時熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上引入了熒光探針或染料,，使得反應(yīng)進程可以實時監(jiān)測,。熔解溫度（Tm，Melting Temperature）作為核酸雙鏈解鏈過程中的一個關(guān)鍵參數(shù),，能夠為引物特異性分析,、突變檢測、產(chǎn)物鑒別等提供重要依據(jù),。
賽默飛科技生產(chǎn)的實時熒光定量PCR儀因其靈敏度,、通量和數(shù)據(jù)分析能力，在多個實驗室中得到廣泛使用,。本文將詳細介紹如何利用賽默飛實時熒光定量PCR儀進行Tm值的測定,，并探討該過程的技術(shù)原理、實驗步驟及其應(yīng)用價值,。
二,、Tm值的基本概念與意義
熔解溫度（Tm值）是指雙鏈DNA變性為單鏈時的溫度，此時有50%的雙鏈DNA分子解鏈,。Tm值受DNA序列長度,、GC含量、離子濃度、DNA濃度等因素影響,。測定Tm值對于以下方面具有重要意義：
引物和探針設(shè)計優(yōu)化：確保擴增的特異性和效率,。
產(chǎn)物鑒別：通過熔解曲線識別不同的擴增產(chǎn)物或雜交探針的結(jié)合差異。
SNP和突變檢測：通過微小Tm值差異區(qū)分單核苷酸變異,。
驗證擴增特異性：避免非特異性擴增對結(jié)果造成干擾,。
三、儀器原理與檢測機制
賽默飛的實時PCR系統(tǒng)通常采用SYBR Green I或TaqMan探針等熒光標記方式來監(jiān)測DNA擴增,。對于Tm值測定,，多采用SYBR Green染料，其在雙鏈DNA存在時發(fā)出熒光,，單鏈時熒光迅速降低,。通過逐步升溫并記錄熒光變化，即可繪制出熔解曲線,，進一步計算Tm值,。
儀器通過以下機制測定Tm值：
熒光信號采集：在升溫過程中持續(xù)監(jiān)測SYBR Green的熒光變化。
熔解曲線分析：熒光信號隨溫度升高而下降,，取導數(shù)（-dF/dT）后得到Tm峰值,。
軟件計算與輸出：賽默飛的軟件可自動識別Tm峰值并輸出精確數(shù)據(jù)。
四,、實驗準備與操作步驟
1. 試劑準備
qPCR Master Mix（含SYBR Green）
引物（Forward/Reverse）
模板DNA
無RNA酶水
2. 反應(yīng)體系配置（以20 µL體系為例）
| 組分 | 體積（µL） |
|---|---|
| SYBR Green Mix | 10 |
| 上游引物（10 µM） | 0.8 |
| 下游引物（10 µM） | 0.8 |
| 模板DNA | 1 |
| 無RNA酶水 | 7.4 |
| 總計 | 20 |
3. PCR反應(yīng)程序設(shè)定
初始變性：95℃,，2分鐘
循環(huán)步驟（40個循環(huán)）：
變性：95℃，15秒
退火/延伸：60℃,，30秒
熔解曲線分析：
起始溫度：60℃
終止溫度：95℃
升溫速率：0.3~1℃/s,，持續(xù)監(jiān)測熒光
4. 數(shù)據(jù)獲取與Tm值分析
實時監(jiān)測熒光并記錄擴增曲線
啟動熔解曲線模塊，導出-dF/dT vs. T圖形
Tm值對應(yīng)曲線峰值所在溫度
五,、結(jié)果判讀與質(zhì)量控制
1. 熔解曲線解析
單一Tm峰：代表擴增產(chǎn)物高度特異,，說明實驗設(shè)計合理。
多重Tm峰：提示非特異擴增或引物二聚體存在,，需優(yōu)化引物或反應(yīng)條件。
Tm值偏低或偏高：可能為GC含量異?；蝮w系緩沖液濃度偏差,。
2. 影響Tm值的因素
GC含量：GC對DNA穩(wěn)定性貢獻高，Tm值隨GC比例升高而提高,。
引物長度：短引物Tm低,，建議設(shè)計長度為18~25 bp。
鹽濃度：高離子強度能穩(wěn)定雙鏈DNA,，提高Tm值,。
DNA濃度：模板過多可能引起熔解曲線畸變。
染料濃度與兼容性：需選擇適合儀器和應(yīng)用的染料。
六,、典型應(yīng)用舉例
1. 突變檢測（如SNP分析）
通過引物或探針與目標序列結(jié)合后的Tm差異識別堿基突變,。例如，某位點A→G突變可導致Tm值從78.5℃變?yōu)?6.3℃,。
2. 引物篩選
在多個候選引物中,，通過測定Tm值及熔解曲線形態(tài)選出特異性強、產(chǎn)物純凈的引物組合,。
3. 產(chǎn)物鑒定
針對擴增產(chǎn)物的Tm值進行比對,，輔助確認擴增物是否為預(yù)期序列，尤其適用于無電泳分析條件下的高通量實驗,。
七,、注意事項與實驗優(yōu)化建議
引物設(shè)計軟件推薦使用Primer3、Oligo等,，并確保Tm值相近（差值≤2℃）,。
設(shè)定熔解曲線前應(yīng)關(guān)閉擴增熒光，以避免干擾,。
若發(fā)現(xiàn)Tm值波動較大,，建議優(yōu)化Mg2?濃度、PCR循環(huán)參數(shù)或更換試劑批次,。
對多重PCR反應(yīng),，Tm值分布應(yīng)盡量錯開，便于識別各目標產(chǎn)物,。
八,、結(jié)語
通過實時熒光定量PCR儀測定Tm值，實驗人員可以獲得關(guān)于擴增特異性,、產(chǎn)物性質(zhì),、突變識別等多方面的重要信息。賽默飛實時PCR平臺配合高分辨率熔解曲線分析功能,，使得Tm值測定更為精準,、穩(wěn)定。該技術(shù)在基因分型,、病原檢測,、轉(zhuǎn)基因篩查等場景中已得到廣泛應(yīng)用。合理利用這一工具,，能夠顯著提高實驗效率與數(shù)據(jù)質(zhì)量,。
如果你還需要加入具體軟件截圖操作、實例圖譜說明或針對某一儀器型號（如QuantStudio系列）進行補充,，我可以繼續(xù)為你細化內(nèi)容,。
