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賽默飛ABI 7500實時熒光定量PCR儀技術(shù)介紹
一,、設(shè)備概述
ABI 7500實時熒光定量PCR儀是Thermo Fisher Scientific旗下Applied Biosystems系列的一款用于核酸定量分析的實驗設(shè)備。該系統(tǒng)集成了高精度溫控模塊,、熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)與分析軟件,，可用于多種分子生物學(xué)實驗中的DNA、RNA擴增與定量分析,，適用于科研,、臨床輔助檢測及教學(xué)實驗等場景。
本儀器采用基于TaqMan探針和SYBR Green等熒光染料的實時檢測技術(shù)，在反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號變化,，以推算擴增產(chǎn)物的起始拷貝數(shù),，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的絕對或相對定量。
二,、主要技術(shù)參數(shù)
反應(yīng)孔數(shù)與反應(yīng)體系
配備標(biāo)準(zhǔn)96孔反應(yīng)模塊,，適配標(biāo)準(zhǔn)0.2 mL PCR管或板；
反應(yīng)體系體積范圍：10–100 μL,。
溫控系統(tǒng)
采用Peltier元件控溫,，升降溫速率可達1.6°C/s；
溫控精度：±0.25°C,；
均一性（Uniformity）：<0.5°C（在90分鐘PCR程序末端）；
設(shè)定溫度范圍：4°C至100°C,；
熱蓋功能可調(diào),，防止樣品蒸發(fā)。
光學(xué)檢測系統(tǒng)
配備高強度氙燈（Xenon Lamp）作為激發(fā)光源,；
五通道檢測,，支持多重?zé)晒鈽?biāo)記（FAM、VIC,、ROX,、SYBR,、TAMRA等）,；
熒光檢測采用多通道濾光片系統(tǒng)，實時采集反應(yīng)曲線,；
數(shù)據(jù)采集精度高,，可實現(xiàn)單拷貝檢測。
軟件系統(tǒng)
使用SDS軟件（System Detection Software）進行實驗設(shè)置與結(jié)果分析,；
支持Ct值分析,、標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建、絕對/相對定量分析,、基因表達分析,、SNP分型、熔解曲線分析等功能,；
數(shù)據(jù)格式兼容性好,，可導(dǎo)出為Excel、CSV等格式,，便于進一步統(tǒng)計分析；
支持圖形可視化、模板管理和自動報告生成,。
三,、系統(tǒng)組成與工作原理
組成結(jié)構(gòu)
主機：包含溫控模塊、熒光激發(fā)與檢測系統(tǒng),、自動熱蓋；
控制終端：PC端軟件連接主機進行控制與數(shù)據(jù)分析,；
電源與通信接口：支持USB連接和LAN網(wǎng)絡(luò),；
軟件套件：含標(biāo)準(zhǔn)實驗?zāi)０濉?shù)據(jù)管理模塊,、統(tǒng)計分析工具,。
工作流程
準(zhǔn)備反應(yīng)體系（包括引物、探針,、模板、反應(yīng)緩沖液）,；
裝載PCR反應(yīng)板至儀器；
設(shè)置PCR程序及熒光采集參數(shù),；
系統(tǒng)按預(yù)設(shè)程序升溫,、擴增并采集熒光信號,；
通過軟件進行結(jié)果分析,，如Ct值計算、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等,。
檢測機制
熒光信號由特定波長激發(fā)并由對應(yīng)波長濾光片檢測,；
每個循環(huán)結(jié)束時采集熒光強度，生成擴增曲線,；
熒光信號與擴增產(chǎn)物數(shù)量成正比,；
使用參考染料（如ROX）進行信號校正，確保結(jié)果穩(wěn)定,。
四,、實驗應(yīng)用舉例
基因表達定量分析
常用于mRNA水平的相對表達分析；
通過ΔΔCt法評估處理組與對照組間的表達變化,；
可用于細胞應(yīng)答研究、基因功能驗證,、藥物作用機制研究,。
基因分型與突變檢測
利用SNP探針進行個體基因型判別,；
可識別單堿基突變、插入缺失等小范圍變異,；
適用于遺傳疾病研究與個體化醫(yī)學(xué)篩查,。
病毒載量檢測
對病毒RNA/DNA進行絕對定量，評估感染程度,；
應(yīng)用于HIV,、HBV、SARS-CoV-2等臨床監(jiān)測,；
支持通過外標(biāo)曲線精確測算目標(biāo)序列拷貝數(shù),。
轉(zhuǎn)基因成分檢測
檢測GMO農(nóng)產(chǎn)品中外源基因存在與含量；
可用于農(nóng)業(yè)監(jiān)管,、食品安全與貿(mào)易合規(guī),。
微生物檢測與菌群分析
快速檢測特定微生物；
可進行定性篩查或定量評價,；
支持16S rRNA等目標(biāo)序列分析,。
五、設(shè)備操作要點與維護建議
操作規(guī)范
嚴(yán)格控制反應(yīng)體積,、試劑濃度及移液準(zhǔn)確性；
每次實驗前需校準(zhǔn)熱蓋與熒光檢測系統(tǒng),；
保持儀器通風(fēng)良好,、無灰塵污染。
維護要點
定期更換光源燈泡并校準(zhǔn)光路,；
檢查并清潔濾光片及熱蓋,；
軟件需定期更新，避免兼容性問題,；
長期不使用時建議拔除電源,，并進行防潮處理。
六,、技術(shù)優(yōu)勢與注意事項
優(yōu)勢特點
操作流程標(biāo)準(zhǔn)化,，適合多用戶共享平臺；
軟件界面清晰,，易于設(shè)置與分析,；
檢測靈敏度高，適合低拷貝序列定量,；
支持多重?zé)晒鈾z測,，節(jié)省時間與樣本量。
常見問題及規(guī)避
空白孔熒光異常：檢查污染或反應(yīng)體系配置錯誤,；
熔解曲線異常：排查引物二聚體,、污染擴增等；
弱陽性/擴增失敗：優(yōu)化引物,、退火溫度或酶系統(tǒng),。
七、總結(jié)與適用性評估
ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)憑借其穩(wěn)定的控溫性能,、靈敏的熒光檢測能力及功能完善的軟件平臺,，在多種分子生物實驗中具有廣泛適用性。其標(biāo)準(zhǔn)化配置與模塊化功能可滿足實驗室對數(shù)據(jù)可重復(fù)性與檢測精度的要求,。作為一款成熟的實時定量PCR平臺,，該設(shè)備尤其適合需要中等通量、標(biāo)準(zhǔn)分析功能的科研單位,、醫(yī)學(xué)檢驗機構(gòu)和高校教學(xué)實驗室,。
