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用電熱恒溫培養(yǎng)箱做大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法,、CaCl2法）等處理后,，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞,，即感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells）,。
實(shí)驗(yàn)方法原理：
帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒，在體外構(gòu)建后,，導(dǎo)入宿主細(xì)胞,，隨著細(xì)胞的大量復(fù)制、繁殖,，才能夠有機(jī)會獲得純的重組質(zhì)粒DNA,，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2,，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后,，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源DNA 的載體分子通過,。
實(shí)驗(yàn)材料：
E. coli DH5α菌株
試劑,、試劑盒：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基,、CaCl2,、硫酸鎂、SOB,、TFB
儀器,、耗材：培養(yǎng)皿,、恒溫?fù)u床,、聚丙烯管,、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機(jī),、無菌工作臺,、燒瓶、恒溫水浴鍋,、低溫冰箱,、制冰機(jī)、分光光度計(jì),、微量移液槍,、錐形瓶、試管
實(shí)驗(yàn)步驟：
1,、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm),，轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h,。一般經(jīng)驗(yàn),，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。
2,、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌,、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中,，在冰上放置10 min,，培養(yǎng)物冷卻至0℃,。
3,、于4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min,，以回收細(xì)胞。
4,、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡,。
5,、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀,。
6,、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min,，以回收細(xì)胞。
7,、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡,。
8、每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀,。
9,、此時,，可以用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可以將細(xì)胞凍存于- 70℃,。
注意事項(xiàng)：
1. 為達(dá)到轉(zhuǎn)化,，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108個細(xì)胞/mL，對于大多散大腦桿菌來說,，這相當(dāng)于OD值為0.4左右,。為保證細(xì)菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高，可每隔15-20 min測定OD600值來監(jiān)測,，用監(jiān)測的時間及OD值列一個圖表,，以便預(yù)測培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時間,，當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時,，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物,。
2. 在菌株與菌株之間,，OD值與每毫升中活細(xì)胞散間的關(guān)系變化很大，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值,，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計(jì)算每一時相的活細(xì)胞散，從而使分光光度計(jì)讀數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化,。
3. 對大多數(shù)大腸桿菌（MC106除外）,，采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果。Dagert和Ehrlieh的實(shí)驗(yàn)(1979)曾表明，細(xì)胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,，在貯存的zui初12-24 h內(nèi),，轉(zhuǎn)化率增加4-6倍，然后降低到初始水平,。
4. 克隆的新鮮程度,，一定要選新鮮平板的單克隆，即剛涂布生長過夜的平板,。
5. 菌體的OD600值,，JM109或BL21,，OD值為0.35，DH5α 為0.4,，要盡量保證OD值不要過高,，更不能超過0.6。
6. 低溫處理的時間,，做完后冰上保存12-24 h后分裝,，并保存于-80℃。
7. 試劑和用品,，所有的用品（離心管,、藥瓶等）用新的，如果使用舊的,，要確保干凈,，CaCl2溶液。