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細胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理后,，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,，成為能允許外源DNA分子進入的細胞，即感受態(tài)細胞（Compenent cells）,。

實驗方法原理：

帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒,，在體外構(gòu)建后，導(dǎo)入宿主細胞,，隨著細胞的大量復(fù)制,、繁殖，才能夠有機會獲得純的重組質(zhì)粒DNA,，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程,。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后,，細胞膜的通透性發(fā)生變化,，能容許外源DNA 的載體分子通過。

實驗材料：

E. coli DH5α菌株

試劑,、試劑盒：LB固體培養(yǎng)基,、LB液體培養(yǎng)基、CaCl2,、硫酸鎂,、SOB、TFB

儀器,、耗材：培養(yǎng)皿,、恒溫搖床、聚丙烯管,、電熱恒溫培養(yǎng)箱,、臺式高速離心機、無菌工作臺,、燒瓶,、恒溫水浴鍋,、低溫冰箱、制冰機,、分光光度計、微量移液槍,、錐形瓶,、試管

實驗步驟：

1,、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm)，轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中,。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h,。一般經(jīng)驗，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL,。

2,、將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的,、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中,，在冰上放置10 min，培養(yǎng)物冷卻至0℃,。

3,、于4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min，以回收細胞,。

4,、倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡,。

5,、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀,。

6、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min,，以回收細胞。

7,、倒出培養(yǎng)液,，將管倒置1  min以使zui后的痕量培養(yǎng)液流盡。

8,、每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉淀,。

9,、此時，可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉(zhuǎn)化實驗,，也可以將細胞凍存于- 70℃,。

注意事項：

1.  為達到轉(zhuǎn)化，活細胞數(shù)務(wù)必少于108個細胞/mL,，對于大多散大腦桿菌來說,，這相當于OD值為0.4左右。為保證細菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高,，可每隔15-20 min測定OD600值來監(jiān)測,，用監(jiān)測的時間及OD值列一個圖表，以便預(yù)測培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時間,，當OD600值達到0.35時,，收獲細菌培養(yǎng)物。

2.  在菌株與菌株之間,，OD值與每毫升中活細胞散間的關(guān)系變化很大,，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞散,，從而使分光光度計讀數(shù)得到標準化,。

3.  對大多數(shù)大腸桿菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果,。Dagert和Ehrlieh的實驗(1979)曾表明,，細胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在貯存的zui初12-24 h內(nèi),，轉(zhuǎn)化率增加4-6倍,，然后降低到初始水平。

4.  克隆的新鮮程度,，一定要選新鮮平板的單克隆,，即剛涂布生長過夜的平板。

5.  菌體的OD600值,，JM109或BL21，OD值為0.35,，DH5α 為0.4,，要盡量保證OD值不要過高，更不能超過0.6,。

6.  低溫處理的時間,，做完后冰上保存12-24 h后分裝，并保存于-80℃。

7.  試劑和用品,，所有的用品（離心管,、藥瓶等）用新的，如果使用舊的,，要確保干凈,，CaCl2溶液。