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   用電熱恒溫培養(yǎng)箱做大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗

   粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面的質(zhì)粒DNA在42攝氏度下經(jīng)過短時間的熱擊處理,，為DNA的吸收起到促進(jìn)作用,，之后于非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，等到質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá),，就能夠生長在還有抗菌素的培養(yǎng)基中了,。以下就是大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗的具體內(nèi)容。

   實驗?zāi)康?/span>

1.向大腸桿菌受體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入重組的DNA分子進(jìn)行復(fù)制,，增殖以及表達(dá)從而獲取目的基因,。

2.對大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞效果進(jìn)行驗證。

3.分子生物學(xué)其他研究的使用,。

   實驗所需器材

   超凈工作臺,，酒精燈，玻璃涂棒,，恒溫培養(yǎng)箱,，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床,，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp）,，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架,，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯⒘恳埔喝悠?，移液器吸頭,，旋渦混合器。

   實驗所需材料和試劑

   無菌ddH2O,，20%IPTG（M/V）,，2%X-gal（M/V,，用N,N-二甲基甲酰胺配），培養(yǎng)基（不加抗菌素）,，LB培養(yǎng)基（加抗菌素）,，質(zhì)粒DNA，重組DNA,，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）,、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。

   實驗操作步驟

1.首先調(diào)節(jié)恒溫水浴的溫度,，將其調(diào)至42℃,。

2.將一管（100μl）感受態(tài)菌由零下70℃的超低溫冰柜中取出，立刻使用手指將其加溫融化,，然后插入冰中,，對其進(jìn)行5-10分鐘冰浴。

3.將10μl連接產(chǎn)物（通常是全部連接產(chǎn)物,，DNA含量大于或等于100ng）加入,，輕輕震蕩后放置冰上20分鐘。

4.將其輕輕搖勻后插入42℃水浴中,，進(jìn)行90s的熱休克,，然后迅速放回冰中，靜置3-5分鐘,。

5.將900μl不含抗菌素的LB培養(yǎng)基分別加入到上述各管中輕輕混勻,，之后再搖床的彈簧架上固定，將其在37攝氏度下震蕩30-50分鐘,。

6.往含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中分別滴加從超凈工作臺中取出的100~300μl上述轉(zhuǎn)化混合液,，使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的

玻璃涂布棒進(jìn)行均勻的涂布。

7.若載體和宿主菌對于藍(lán)白斑篩選合適的話,，那么在滴完菌液后再將8μl20%IPTG,，40μl2%X-gal滴加于平板上，使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的玻璃涂布棒進(jìn)行均勻的涂布,。

8.標(biāo)記涂好的培養(yǎng)皿,，先放置在37攝氏度電熱恒溫培養(yǎng)箱中30-60分鐘，待表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,，再倒過來放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜,。

9.使用酒精對被細(xì)菌污染的桌面進(jìn)行消毒，寫實驗報告,。

10.對于平板上長出的菌落克隆進(jìn)行觀察,，如果菌落之間能互相分開，說明實驗結(jié)果好，對于白色菌斑需要特別留意,。