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可以用電熱恒溫培養(yǎng)箱做微生物菌種的擴(kuò)大培養(yǎng),?

閱讀:1562        發(fā)布時(shí)間:2022/3/29
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   現(xiàn)代工業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模越來(lái)越大,每只發(fā)酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米,。因此要在短時(shí)間內(nèi)完成發(fā)酵,,必須要有數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要獲得數(shù)量足夠的健壯的微生物,。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管,、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后,再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程,。這些純種培養(yǎng)物稱為種子,。微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來(lái),產(chǎn)率有了很大的提高,,然而防止雜菌污染的要求也更高了,。

  人們?cè)谂c雜菌污染的斗爭(zhēng)中,積累總結(jié)出很多寶貴的經(jīng)驗(yàn),。規(guī)范了管理措施,,設(shè)計(jì)了一系列設(shè)備(例如密閉式發(fā)酵罐,培養(yǎng)基滅菌設(shè)備,,無(wú)菌空氣制備設(shè)備等)和管道,,應(yīng)用了無(wú)菌室甚至無(wú)菌車間,建立了無(wú)菌操作技術(shù),,因而大大降低了發(fā)酵染菌率,。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅,染菌后輕者影響產(chǎn)率,、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量,,重者造成“倒罐",不但浪費(fèi)大量原材料,,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,,還會(huì)對(duì)周圍環(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染,,及早發(fā)現(xiàn)雜菌并采取相應(yīng)措施,,對(duì)減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要。因此檢查的方法要求準(zhǔn)確,、快速,。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個(gè)時(shí)期。

  種子培養(yǎng)期染菌的危害最大,因嚴(yán)格防止,。一旦發(fā)現(xiàn)種子染菌,,均應(yīng)滅菌后棄去,并對(duì)種子罐及其管道進(jìn)行*滅菌,。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富,,容易染菌,此時(shí)養(yǎng)分消耗不多,,應(yīng)將發(fā)酵液補(bǔ)足必要養(yǎng)分后迅速滅菌,,并重新接種發(fā)酵。發(fā)酵中期染菌不但嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌株的代謝,,而且會(huì)影響產(chǎn)物的生成,,甚至使已形成的產(chǎn)物分解。由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗,,代謝產(chǎn)物的生成又不是很多,,挽救處理比較困難,可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑,。如果是發(fā)酵后期染菌,此時(shí)產(chǎn)物積累已較多,,糖等養(yǎng)分已接近耗盡,,若染菌不嚴(yán)重,可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵;若污染嚴(yán)重,,可提錢放罐,。染菌程度越重,危害越大;染菌少,,對(duì)發(fā)酵的影響就小,。所以,實(shí)際生產(chǎn)中,,應(yīng)當(dāng)根據(jù)污染程度和發(fā)酵時(shí)期區(qū)別對(duì)待,。

  1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.1 器材

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái),、帶搖床的培養(yǎng)箱,、顯微鏡、天平,、三角瓶,、試管、移液管,、培養(yǎng)皿,、 接種針、平板涂布器、酒精燈,、載玻片

1.2 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂,、葡萄糖、磷酸二氫氨,、七水合MgSO4,、氯化鈉、磷酸氫二鉀,、牛肉膏,、蛋白胨、0.4%酚紅溶液,、蒸餾水,、番紅染液、香柏油,、擦鏡液

1.3培養(yǎng)基

(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:直接稱量營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉4.5g,,溶于100mL蒸餾水配制,pH7.2,,分裝到試管中,, 滅菌后擺成斜面。

(2)種子培養(yǎng)基:葡萄糖 0.5%,、磷酸二氫氨 0.1%,、七水合MgSO4 0.02%、氯化鈉 0.5%,、磷酸氫二鉀 0.1%

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基: 牛肉膏 0.3%,、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%,、 氯化鈉 0.5%,、 0.4% 酚紅溶液,pH7.2

  2實(shí)驗(yàn)方法

2.1種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

2.1.1斜面培養(yǎng)基的配制

配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,,分裝,,滅菌(121℃條件下滅菌 30min),倒斜面,。

2.1.2菌種的活化

⑴將大腸桿菌采用無(wú)菌操作的方法接種于斜面上,,在電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)18h;

⑵培養(yǎng) 18h 后,觀察菌落顏色是否一致,,若均為黃色,,挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè);若顏色有黃有白,則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè),。檢測(cè)方法常用染色鏡檢,,若檢測(cè)后,沒(méi)有污染,便可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);若檢測(cè)到雜菌,,要重復(fù)上述步驟,,直到無(wú)菌為止,否則,,不能繼續(xù)下一步操作,。

2.1.3擴(kuò)大培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下,從檢測(cè)后的活化培養(yǎng)基上挑取10個(gè)左右菌落,,用接種針接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中,,于37℃下振蕩培16-18h,觀察菌落形態(tài),。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察,,根據(jù)結(jié)果來(lái)判斷能否進(jìn)行下一步。

2.2污染的檢測(cè)和判別

2.2.1顯微鏡檢查

⑴取樣:用無(wú)菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上;

⑵制片,、染色:自然風(fēng)干后,用番紅染液染色 1-2min,,水洗;

⑶干燥后用油鏡下觀察。

2.2.2平板檢查

⑴配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,,滅菌,,倒平板;

⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約 10–6~10–7) 后涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,在37℃下培養(yǎng) 24h;

⑶觀察菌落形態(tài),。

2.2.3肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否*)

將1ml待測(cè)液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中,,于電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)24h,觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色,。

  3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

觀察到在活化培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大量菌落,且菌落顏色單一,,均為淡黃色,。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量,制作裝片,,染色后在顯微鏡下觀察,,發(fā)現(xiàn)多個(gè)視野中都為桿菌,可初步得出活化的菌種中沒(méi)有污染雜菌,。挑取沒(méi)有污染雜菌的菌落,,用無(wú)菌操作技術(shù)接種,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),。在適宜條件下培養(yǎng)18h后,,得到了大腸桿菌的種子液,吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌,。

3.2 顯微鏡檢查

鏡檢時(shí),,多個(gè)視野中均觀察到的均為桿菌,呈鏈狀或單個(gè)存在,沒(méi)有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細(xì)菌,,因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染,。

3.3 平板檢查

從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊,、表面光滑,、半透明或乳白色、菌落上有小的突起,,這是典型的大腸桿菌菌落,,沒(méi)有觀察到其它形態(tài)的菌落,因此可初步認(rèn)為該種子液中沒(méi)有雜菌污染,。

3.4 肉湯檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否*

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液,,酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色,堿性環(huán)境中呈紅色,。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測(cè)液若有菌體存在,,則菌體代謝會(huì)使培養(yǎng)基呈酸性,顯示黃色,。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后,,仍呈現(xiàn)紅色,沒(méi)有變?yōu)辄S色,,且澄清,,未渾濁,說(shuō)明待測(cè)液中沒(méi)有菌體存在,,,,因此,所測(cè)的滅菌種子培養(yǎng)基中沒(méi)有被菌體污染,。

4實(shí)驗(yàn)討論

4.1 在種子的擴(kuò)大培養(yǎng)前要對(duì)菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子,,若菌種已活化則可省略這一步。種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí),,如果低溫保藏的菌種污染了雜菌,,則應(yīng)棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來(lái)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)。

4.2 采用顯微鏡檢查法,,如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標(biāo)菌株不同形態(tài)的菌體則可認(rèn)為是污染了雜菌,,該法簡(jiǎn)便、快速,,能及時(shí)檢查出雜菌,。但是也有其不足之處:①對(duì)含雜菌少的樣品不易得出正確的結(jié)論,故應(yīng)多檢查幾個(gè)視野;②由于菌體較小,,本身又處于非同步狀態(tài),,應(yīng)注意不同生理狀態(tài)下目標(biāo)菌與雜菌的區(qū)別,,必要時(shí)可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對(duì)固形物多的發(fā)酵液檢查較困難,。

4.3 采用平板檢查法,,若出現(xiàn)與目標(biāo)菌株形態(tài)不一的菌落,就表明可能被雜菌污染;若要進(jìn)一步確證,,可配合顯微鏡形態(tài)觀察,,若個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標(biāo)菌相異,則可確認(rèn)污染了雜菌,。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測(cè),,形象直觀,肉眼可辨,,不需儀器,。但需嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作技術(shù),所需時(shí)間較長(zhǎng),,而且無(wú)法區(qū)分形態(tài)與目標(biāo)菌相似的雜菌,。在污染初期,目標(biāo)菌占絕大部分,,污染菌數(shù)量很少,,所以要做比較多的平行試驗(yàn)才能檢出污染菌。

4.4 肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來(lái)檢測(cè)培養(yǎng)基的滅菌是否*,,不適用于發(fā)酵液的檢查,。

4.5 可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來(lái)檢測(cè)是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過(guò)程中,,以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo),,以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標(biāo),作曲線,,若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化,,則很可能是污染了雜菌。但是,,發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌,。

  5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

  本實(shí)驗(yàn)我們了解了種子制備的方法和發(fā)酵污染的危害,,知道染菌不僅浪費(fèi)大量原材料,,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且污染了環(huán)境,,所以,,在種子活化培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中每一步均需進(jìn)行無(wú)雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來(lái)檢測(cè)雜菌污染,,方法較為簡(jiǎn)便,、形象直觀,,但是,若要進(jìn)行更準(zhǔn)確的檢測(cè),,最好再做較多的平行實(shí)驗(yàn),。肉湯培養(yǎng)檢查法是用于檢測(cè)培養(yǎng)基滅菌是否*的有效方法。


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