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仔豬生精細(xì)胞體外培養(yǎng),、增殖及分化研究
本實驗通過比較兩種生精細(xì)胞(spermatogenenic cell)的培養(yǎng)方法,，觀察生精細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的生長行為,，并檢測增殖分化情況，以建立發(fā)生體外培養(yǎng)系統(tǒng),，為進一步研究發(fā)生機理奠定基礎(chǔ),，并為治療雄性不孕、闡明環(huán)境污染物對雄性生殖的損害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),，還能為制備轉(zhuǎn)基因動物,、挽救瀕危野生動物提供新的思路。
采用生精細(xì)胞混合培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)進行仔豬睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng),，分別從生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程存活率,、存活時間及分化程度等方面進行比較,。結(jié)果顯示生精細(xì)胞混合培養(yǎng)過程中,，檢測第1d)存活率為(91.66±0.46)％，第2d存活率達到(95.41±1.11)％,，第3d存活率降低為(94.15±0.32)％,；組織塊培養(yǎng)中生精細(xì)胞存活率一直較高且穩(wěn)定，檢測第1d存活率為(96±0.58)％,，隨著培養(yǎng)時間延長,，存活率逐步上升，第2d,、3d存活率均為98％,，與混合培養(yǎng)存活率相比，存活率差異極顯著(F=62.15,，P＜0.001：q=3.59,，P＜0.001)；生精細(xì)胞混合培養(yǎng)5d后,，生精細(xì)胞分化的最高程度為次級精母細(xì)胞,，組織塊培養(yǎng)9d后生精細(xì)胞分化的最高程度為四分體細(xì)胞。
為了進一步了解睪丸組織塊培養(yǎng)體系中生精細(xì)胞增殖及分化情況,。本實驗采取以下培養(yǎng)條件：DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，每毫升培養(yǎng)液中含有100IU青鏈霉素、Vc(10~(-4)M),、VE(10μg／ml),、FSH(10~(-4)mg／ml)、胰島素—轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg／ml),，34℃,，5％CO2，95％空氣氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),，對仔豬睪丸組織塊進行了2～4周體外培養(yǎng),。
通過溴脫氧核苷尿嘧啶(5′-Bromo-2-deoxyuridine,，BrdU)體外標(biāo)記S期生精細(xì)胞DNA，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測生精細(xì)胞體外增殖情況,；采用HE染色及透射電子顯微鏡技術(shù)從普通生態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)兩個方面檢測體外培養(yǎng)前后生精細(xì)胞分化程度,。結(jié)果顯示：(1)Brdu標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過15d,，20d體外培養(yǎng)后生精細(xì)胞增殖明顯,，體外培養(yǎng)15d可見大部分生精細(xì)胞以集落形式存在，呈念珠狀或啞鈴狀,，少數(shù)細(xì)胞以單細(xì)胞形式存在,，集落包含有2-cell、4-cell,、6-cell等偶數(shù)生精細(xì)胞集落,，也包含奇數(shù)細(xì)胞個數(shù)的細(xì)胞集落，如3-cell,、5-cell,、9-cell等，主要為小于10-cell細(xì)胞集落,。
體外培養(yǎng)20d,，熒光顯微鏡圖顯示，仍可見許多細(xì)胞集落,，集落多為2-cell及單個的生精細(xì)胞,。(2)HE染色結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)15d,，精原細(xì)胞通過間橋連接附著于支持細(xì)胞上,，支持細(xì)胞核不規(guī)則，以2個核仁常見,，偶見正在分裂的次級精母細(xì)胞,，未見細(xì)胞；體外培養(yǎng)第20d,，可見多個正在分裂的次級精母細(xì)胞,，還觀察到Sb、Sc型細(xì)胞,，Sb型細(xì)胞胞核為圓形,，胞核為藍紫色，胞核略微偏向一極,；Sc型細(xì)胞胞核卵圓形,，藍紫色，核偏極程度比Sc嚴(yán)重，染色質(zhì)較Sb致密,。(3)透射電子顯微鏡結(jié)果表明支持細(xì)胞胞質(zhì)不如培養(yǎng)前豐富,，線粒體明顯減少、輕度腫脹,，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯變化,。
體外培養(yǎng)后觀察到了2個典型細(xì)胞，胞核呈“蘋果"狀,，在細(xì)胞核頂端有高電子密度頂體囊泡形成,，胞核一側(cè)可見高爾基體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),，線粒體由培養(yǎng)前的形態(tài)正常,、豐富變?yōu)榕囵B(yǎng)后的輕度、高度腫脹,，且較培養(yǎng)前數(shù)量減少,。 結(jié)論：(1)本實驗條件下組織塊培養(yǎng)生精細(xì)胞體外存活率更高，生精細(xì)胞分化程度較高：(2)睪丸組織塊培養(yǎng)的生精細(xì)胞能夠在體外較好增殖,，通過細(xì)胞間橋連接小于10個生精細(xì)胞集落,，生精細(xì)胞集落包含偶數(shù)、奇數(shù)個細(xì)胞,；(3)HE染色普通形態(tài)學(xué)及透射電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)均顯示生精細(xì)胞能夠在體外分化為細(xì)胞。