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微生物的培養(yǎng)與分離方法
核心提示：大多數(shù)細(xì)菌均可以通過人工方法培養(yǎng),，只有將微生物培養(yǎng)出來才能對(duì)它進(jìn)行研究、鑒定和應(yīng)用,。
接種與分離方法
根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì),、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法,。
1．平板劃線分離培養(yǎng)法
對(duì)混有多種細(xì)菌,，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離,，得到分散的單個(gè)菌落,，以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法：
①分區(qū)劃線分離法：此法常用于含菌量較多的細(xì)菌的分離,。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)（占培養(yǎng)基總面積的¼）并作數(shù)條劃線,，再于2、3、4區(qū)依次劃線,。每劃完一個(gè)區(qū)域,，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域,，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接1~3次,。一個(gè)成功分區(qū)劃線的平板，培養(yǎng)后分別觀察1區(qū)形成菌苔,，2區(qū)菌落連成線,，3區(qū)和4區(qū)可分離到單個(gè)菌落。
②連續(xù)劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培養(yǎng)物中的細(xì)菌分離培養(yǎng),。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹,，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線連續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面,。
2.瓊脂斜面接種法
主要用于菌落的移種,，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個(gè)菌落或培養(yǎng)物,，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線,，然后再從底部沿直線向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止,。生化鑒定培養(yǎng)基斜面接種,，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部,，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種,。
3．穿刺接種法
此法多用于半固體培養(yǎng)基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種,，半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力,。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺入至距管底0.4cm處,，再沿穿刺線退出接種針,。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺高層部分,，退出接種針后直接劃線接種斜面部分,。
4．液體培養(yǎng)基接種法
用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水,、糖發(fā)酵管等的接種,。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培養(yǎng)管,，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準(zhǔn)）,。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸,，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌,，以免形成氣溶膠,，造成實(shí)驗(yàn)室污染。
5．傾注平板法
本法主要用于飲水,、飲料,、牛乳等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi),，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15~20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻,，待凝固后置37℃,，電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),，以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù),。先數(shù)6個(gè)方格（每格為1cm2）中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù),，并算出平皿直徑,，然后按下列公式計(jì)數(shù)，求出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù),。
全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)×лr2
每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)
6．涂布接種法
本法多用于紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌接種,。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布,，使被接種液均勻分布于瓊脂表面,，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng),，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔,。
細(xì)菌的培養(yǎng)方法
根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)方法,。通常把細(xì)菌的培養(yǎng)方法分為需氧培養(yǎng),、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)四種,。
1．需氧培養(yǎng)
是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng),，將已接種好的平板、斜面,、液體培養(yǎng)基等在空氣中置35℃孵育箱內(nèi)孵育18~24h,，無特殊要求的細(xì)菌均可生長(zhǎng)。少數(shù)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌需要培養(yǎng)3-7d甚至1個(gè)月才能生長(zhǎng),。為使孵育箱內(nèi)保持一定的濕度,，可在其內(nèi)放置一杯水。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的培養(yǎng)基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固,，以防培養(yǎng)基干裂,。
2．二氧化碳培養(yǎng)
某些細(xì)菌，在初次分離時(shí),，須在5%~10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長(zhǎng),。常用的培養(yǎng)法如下。
①二氧化碳培養(yǎng)箱法：二氧化碳培養(yǎng)箱能自動(dòng)調(diào)節(jié)二氧化碳的含量,、溫度和濕度,，培養(yǎng)物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時(shí)間后可直接觀察生長(zhǎng)結(jié)果,。
②燭缸培養(yǎng)法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器,，將接種好的培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培養(yǎng)物的位置上,，缸蓋或缸口均涂以凡士林,，加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭燃燒氧逐漸減少,，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅,，此時(shí)容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內(nèi)孵育,。
③氣袋法：選用無毒透明的塑料袋,，將已接種標(biāo)本的培養(yǎng)皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口,。使袋呈密閉狀態(tài),，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管（安瓿）產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可達(dá)到需要的二氧化碳培養(yǎng)環(huán)境,，置于35℃孵育箱內(nèi)孵育,。
④化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例,，分別置容器內(nèi),，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋緊密封,，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳,。于35℃孵育箱內(nèi)孵育。
3．微需氧培養(yǎng)
微需氧菌培養(yǎng)在大氣中及無氧環(huán)境中均不能生長(zhǎng),，在含有5%-6% 氧氣,，5%-10%二氧化碳和85%氮?dú)獾臍怏w環(huán)境中才可生長(zhǎng)，將標(biāo)本接種到培養(yǎng)基上,，置于上述氣體環(huán)境中,，35℃進(jìn)行培養(yǎng)即微需氧培養(yǎng)法,。
4．厭氧培養(yǎng)
厭氧菌對(duì)氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成低氧化還原電勢(shì)的厭氧環(huán)境,。厭氧培養(yǎng)常用的方法有：物理法,、化學(xué)法、生物法,。如厭氧罐培養(yǎng)法,、氣袋法、厭氧手套箱法,、需氧菌共生厭氧法等,。
細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特性
1．固體培養(yǎng)基標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán),，稱為菌落（colony）,。
①菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀,、圓形、菜花樣,、不規(guī)則等）,、突起或扁平、凹陷,、邊緣（光滑,、波形、鋸齒狀,、卷發(fā)狀等）,、顏色（紅色、灰白色,、黑色,、綠色、無色,、黃色等）,、表面（光滑、粗糙等）,、透明度（不透明,、半透明、透明等）和粘度等,。據(jù)細(xì)菌菌落表面特征不同,，可將菌落分為3型：
A.光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤(rùn),、邊緣整齊,，新分離的細(xì)菌大多呈光滑型菌落,。
B.粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥,、呈皺紋或顆粒狀,，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成,。R型細(xì)菌抗原不完整,，毒力和抗吞噬能力都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分離的毒力株就是R型,，如炭疽孢桿菌,、結(jié)核分枝菌等。
C.粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠,、有光澤,、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌,、結(jié)核桿菌等,。
②菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。
α溶血：又稱草綠色溶血,，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán),，為高鐵血紅蛋白所致；
β溶血：又稱*溶血,，菌落周圍形成一個(gè)*清晰透明的溶血環(huán),，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞*溶解所致；
γ溶血：即不溶血,，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化,，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。
③色素：有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素,，使菌落和周圍的培養(yǎng)基出現(xiàn)綠色,、金黃色、白色,、橙色,、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性,。
④氣味：某些細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味,，如銅綠假單胞菌（生姜?dú)馕叮⒆冃螚U菌（巧克力燒焦的臭味）,、厭氧梭菌（惡臭味）,、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。
2．液體培養(yǎng)基細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有3種生長(zhǎng)現(xiàn)象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖后呈均勻混濁,；少數(shù)鏈狀排列的細(xì)菌如鏈球菌,、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長(zhǎng),；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長(zhǎng),，常形成菌膜,。
3．半固體培養(yǎng)基
半固體培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌動(dòng)力試驗(yàn)，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外,，在穿刺線兩側(cè)也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng),。無鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)，穿刺線兩邊的培養(yǎng)基仍然澄清透明,，為動(dòng)力試驗(yàn)陰性,。