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細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)
隨著二氧化碳培養(yǎng)箱的普及，現(xiàn)在用二氧化碳培養(yǎng)箱來做實(shí)驗(yàn)的人越來越多,，下面喆圖小編就給大家講解一下細(xì)胞克隆的實(shí)驗(yàn)方法,。
細(xì)胞克隆或集落的原理：
當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體,，成為集落或克隆,。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0mm之間,。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力,。克隆形成率反映細(xì)胞兩個(gè)重要性狀：細(xì)胞群體依賴性,、增殖能力,。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大：
a）.初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱,，傳代細(xì)胞系強(qiáng),；
b）.二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng),；
c）.正常細(xì)胞克隆形成率弱,，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)方法
1.平板集落形成實(shí)驗(yàn)：本法適用于貼壁生長的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的細(xì)胞,。
注：適宜底物為玻璃的,、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度,。細(xì)胞一定要分散得好,，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大,。
2.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)：本法適用于非錨著依賴性生長的細(xì)胞,，如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株,、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系,。
注：正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn),。
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟：
1.取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞,，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用,。
2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞分別以每皿50、100,、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中,，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻,。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周,。
3.經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),，終止培養(yǎng),。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次,。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘,。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘,，然后用流水緩慢洗去染色液,，空氣干燥。
4.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。后計(jì)算克隆形成率,。
克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%
二,、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)基本步驟：
1.取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打,，使之成為單細(xì)胞,，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L,。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋,。
2.用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后,，維持在40℃中不會凝固。
3.按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL),，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用,。
4.按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后,，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻,，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中,，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天,。
5.把平皿放置在倒置顯微鏡下,，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率,。 軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系,。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40℃,。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè),，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。
注意事項(xiàng)
1.接種時(shí)細(xì)胞密度適度,，不可過高,。
2.軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不能超過40℃，否則將會燙傷/死細(xì)胞,；
3.瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定,，若反復(fù)加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性,，且硬度下降,。因此高壓滅菌后應(yīng)進(jìn)行分裝；
4.細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度,，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會受到很大影響,；
5.細(xì)胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng),，生存率明顯下降,，永生細(xì)胞系/株克隆形成率可達(dá)到10%以上，但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限傳代細(xì)胞系克隆形成率僅為0.5%-5%,，甚至無法形成單個(gè)克隆,。因此，為了提高克隆形成率,，有時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加胰島素,、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)。
6.細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù),，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆,。做克隆形成率測定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液,，直接接種在碟皿中,，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查,，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng),。
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