日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

     電熱恒溫培養(yǎng)箱采用電熱膜加熱方式，在箱體與內(nèi)膽之間安裝電熱膜,，使用熱傳遞方式加熱,，加熱速度快。多應(yīng)用于實驗室的各種細胞菌類的培養(yǎng),，今天要說的是大腸桿菌,，下面喆圖小編講一些操作流程供大家參考一下,。

     細胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理后,，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,，成為能允許外源DNA分子進入的細胞，即感受態(tài)細胞（Compenent cells）,。

實驗方法原理：

     帶有外源DNA 的重組質(zhì)粒,，在體外構(gòu)建后，導(dǎo)入宿主細胞,，隨著細胞的大量復(fù)制,、繁殖，才能夠有機會獲得純的重組質(zhì)粒DNA,，該過程稱之為轉(zhuǎn)化過程,。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理后,，細胞膜的通透性發(fā)生變化,，能容許外源DNA 的載體分子通過。

實驗材料：

E. coli DH5α菌株

試劑,、試劑盒：LB固體培養(yǎng)基,、LB液體培養(yǎng)基、CaCl2,、硫酸鎂,、SOB、TFB

儀器,、耗材：培養(yǎng)皿,、恒溫搖床、聚丙烯管,、電熱恒溫培養(yǎng)箱,、臺式高速離心機、無菌工作臺,、燒瓶,、恒溫水浴鍋、低溫冰箱,、制冰機,、分光光度計、微量移液槍,、錐形瓶,、試管

實驗步驟：

1、從37℃培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm)，轉(zhuǎn)到一個含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中,。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)3 h,。一般經(jīng)驗，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL,。

2,、將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的,、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min,，培養(yǎng)物冷卻至0℃,。

3、于4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min,，以回收細胞,。

4、倒出培養(yǎng)液,，將管倒置1 min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡,。

5、每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀,。

6、于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min,，以回收細胞,。

7、倒出培養(yǎng)液,，將管倒置1min以使后的痕量培養(yǎng)液流盡,。

8、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉淀,。

9,、此時，可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉(zhuǎn)化實驗,，也可以將細胞凍存于-70℃,。

注意事項：

1.為達到轉(zhuǎn)化，活細胞數(shù)務(wù)必少于108個細胞/mL,，對于大多散大腸桿菌來說,，這相當于OD值為0.4左右。為保證細菌培養(yǎng)物的生長密度不致過高,，可每隔15-20min測定OD600值來監(jiān)測,，用監(jiān)測的時間及OD值列一個圖表，以便預(yù)測培養(yǎng)物的OD600值到0.4的時 間，當OD600值達到0.35時,，收獲細菌培養(yǎng)物,。

2.在菌株與菌株之間，OD值與每毫升中活細胞散間的關(guān)系變化很大,，因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養(yǎng)物在生長周期的不同時相的OD600值,，并將各稀釋維度的培養(yǎng)物鋪于無抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞散，從而使分光光度計讀數(shù)得到標準化,。

3.對大多數(shù)大腸桿菌（MC106除外）,，采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結(jié)果。Dagert和Ehrlieh的實驗(1979)曾表明,，細胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,，在貯存的初12-24 h內(nèi)，轉(zhuǎn)化率增加4-6倍,，然后降低到初始水平,。

4.克隆的新鮮程度，一定要選新鮮平板的單克隆,，即剛涂布生長過夜的平板,。

5.菌體的OD600值，JM109或BL21,，OD值為0.35,，DH5α為0.4，要盡量保證OD值不要過高,，更不能超過0.6,。

6.低溫處理的時間，做完后冰上保存12-24h后分裝,，并保存于-80℃,。

7.試劑和用品，所有的用品（離心管,、藥瓶等）用新的,，如果使用舊的，要確保干凈,，CaCl2溶液,。