NADP-蘋果酸酶（Malic enzyme ,，NADP-ME）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/48 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：
ME 廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞,、動(dòng)物和植物胞漿中,，尤其在植物組織中活性較高。ME 催化蘋果
酸氧化脫羧的可逆反應(yīng),，產(chǎn)生丙酮酸和CO2,，以及伴隨NAD(P)+的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶,。 ME 活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān),。近年來植物 ME 活性測定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn),。根據(jù)輔酶專一性和對底物特異性的不同,，可將ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40),。
測定原理：
NADP-ME 催化NADP+還原成 NADPH，在 340nm 下測定NADPH 增加速率,。
組成：
產(chǎn)品名稱 | BF6009-50T/48S | Storage |
提取液： | 60ml | 4℃ |
試劑一：液體 | 60ml | 4℃ |
試劑二：粉劑 | 1 瓶 | -20℃ |
試劑三：粉劑 | 1 瓶 | -20℃ |
說明書 | 一份 |
試劑二：粉劑×1 瓶,，-20℃保存； 臨用前加入 50ml 試劑一充分振蕩,，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20
度保存，禁止反復(fù)凍融,。
試劑三：粉劑×1 瓶,，-20℃保存；臨用前加入 6ml 蒸餾水充分振蕩,，溶解待用,，用不完的試劑分裝后-20
度保存，禁止反復(fù)凍融,。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì),、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。
樣本的前處理：
1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞
（冰浴,，功率 20％或 200W,，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,；14000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。14000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。
2,、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。
2,、在 1ml 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 850μL 試劑二，混勻,，30℃孵育 5min,，加入 100μL 試劑三，混勻后立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。
NADP-ME 活性計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度,。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位,。
NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T =3215×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-ME（nmo/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T =6.43×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1×10-3 L,；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm,；d：比色皿光徑,， 1cm；V 樣：加入樣本體積,，0.1 ml,；V 樣總：加入提取液體積，1 ml,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500 萬。
