熒光定量PCR儀的核心在于利用熒光信號來實時監(jiān)測PCR過程中DNA或RNA樣本的擴增情況,,從而實現(xiàn)對目標基因的精確定量分析,。在熒光定量PCR中,首先需要將待測樣本與特異性引物,、DNA聚合酶以及熒光基團或熒光標記的探針混合,,形成一個反應體系,。然后,,通過設定特定的PCR程序,,如退火溫度,、延伸時間等,使得DNA片段在PCR儀中進行擴增,。在PCR反應過程中,,每當一個DNA片段被擴增時,與之結(jié)合的熒光基團或探針就會發(fā)出熒光信號,。熒光定量PCR儀通過高靈敏度的熒光檢測系統(tǒng),,實時收集并分析這些熒光信號,,將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號,從而精確地反映出PCR產(chǎn)物的生成量,。
一,、操作步驟
打開電腦和熒光定量PCR儀的軟件,設置PCR儀各通道的光電倍增器(PMT)電壓,。
將需要擴增的樣品模板,、引物、探針和內(nèi)參照熒光探針分別加入到樣品孔和試劑孔中,。
加入PCR擴增試劑,,包括緩沖液、引物,、探針和內(nèi)參照熒光探針,。
啟動PCR擴增儀,設定循環(huán)參數(shù),,包括預變性,、變性、復性,、延伸和熒光檢測條件,。
在每個循環(huán)中,加入相應的預變性液,、復性液,、延伸液和檢測液,并維持一定的時間,。
每次循環(huán)結(jié)束后,,PCR儀自動收集信號并進行數(shù)據(jù)分析。
經(jīng)過多次循環(huán)后,,PCR儀將自動停止運行并輸出結(jié)果,。
二、維護保養(yǎng)
儀器外表應定期用軟布加少數(shù)清水擦洗,,清洗后將儀器擦干,。若有試劑泄漏在儀器外表,應使用軟布加70%酒精擦洗潔凈,。
反應孔應定期清潔,,一般3個月一次,可用吹氣球輕輕吹拭,。為了防止塵土進入反應孔,,儀器不使用時,應關(guān)閉滑蓋,。若有試劑進入樣本孔內(nèi),,應使用無塵軟布加70%酒精擦洗潔凈,。
不要頻頻開關(guān)儀器,兩次開關(guān)間隔時間不得低于30秒,。試驗結(jié)束后不要當即關(guān)閉電源,應待機10分鐘后再關(guān)閉電源,。
應使用原廠商供應的電源線和通訊線,,禁止在儀器上進行沸水浴或低溫保溫(如4℃)。
儀器裝有兩個10A保險絲,,用以保護儀器。當保險絲發(fā)生損壞后,,用戶應按說明書中的方法替換保險絲,。
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