三聯(lián)外置泵微生物限度檢測(cè)儀CYW-300S

微生物的檢測(cè),，無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義,，本文對(duì)生長(zhǎng)量測(cè)定法,、微生物計(jì)數(shù)法,、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測(cè)簡(jiǎn)要介紹了利用微生物重量，體積,，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測(cè)方法,，簡(jiǎn)要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn),。
　　一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下,，不斷的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝,。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量,，體積，大?。┚筒粩嘣黾樱谑浅霈F(xiàn)了個(gè)體的生長(zhǎng)現(xiàn)象,。如果這是一種平衡生長(zhǎng),，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí),，則達(dá)到程度后就會(huì)發(fā)生繁殖,，從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí),，原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體。隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，就引起了這一群體的生長(zhǎng),，這可從其體積、重量,、密度或濃度作指標(biāo)來衡量。微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng),，微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科研上有困難,，通常情況下也沒有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的,，因此,，微生物的生長(zhǎng)通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長(zhǎng)繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映,。因此生長(zhǎng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo),，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病,，霉腐微生物的防治都和他們的生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān),。所以有必要介紹一下微生物生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法。既然生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加,，所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上,。微生物生長(zhǎng)的衡量,，可以從其重量，體積,，密度,，濃度，做指標(biāo)來進(jìn)行衡量,。
　　1. 微生物計(jì)量法
　　1.1 體積測(cè)量法
　　又稱測(cè)菌絲濃度法,，通過測(cè)定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是,，取量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10 mL）放在有刻度的離心管中,，設(shè)定的離心時(shí)間（如5 min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后,，倒出上清夜,，測(cè)出上清夜體積為v,，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo),。這種方法比較粗放,，簡(jiǎn)便，快速,，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件,，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物,，結(jié)果會(huì)有偏差,。
　　稱干重法
　　可用離心或過濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10~20%,。在離心法中,，將體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速,，進(jìn)行離心,，并用清水離心洗滌1~5次，進(jìn)行干燥,。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干,，或采用紅外線烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥,，干燥后稱重,。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾,，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾,，過濾后用少量水洗滌，在40 ℃下進(jìn)行真空干燥,。稱干重發(fā)法較為煩瑣,，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料,。
　　1.3 比濁法
　　微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高,。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況,。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí),，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中,，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況,，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì),，在波長(zhǎng)600 nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600,，以此監(jiān)控E.coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。
　　1.4 菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法
　　對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌,，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度,，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基,，臥放,，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度,，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng),。
　　2. 微生物計(jì)數(shù)法三聯(lián)外置泵微生物限度檢測(cè)儀CYW-300S
　　2.1 血球計(jì)數(shù)板法
　　血球計(jì)數(shù)板是一種有結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴,，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái),，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng),，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格,。通過油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)大格內(nèi)微生物的數(shù)量,，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù),。這種方法簡(jiǎn)便，直觀,，快捷,，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù),。
　　2.2 染色計(jì)數(shù)法
　　為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法,。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液,，染色后在顯微鏡下觀察,，活細(xì)胞為無色,，而死細(xì)胞為藍(lán)色,。
　　2.3 比例計(jì)數(shù)法
　　將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度,。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.4 液體稀釋法
　　對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,，根據(jù)估計(jì)數(shù),，從適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中,，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù),，然后查大或然數(shù)表MPN（Most Probable Number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量,。該法常用于食品中微生物的檢測(cè),，例如飲用水和牛奶的微生物。
　　2.5 平板菌落計(jì)數(shù)法
　　這是一種常用的活菌計(jì)數(shù)法,。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋,，取體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上,。保溫培養(yǎng)后,，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù),。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50~500個(gè)菌落為宜,。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù),。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆,。
　　2.6 試劑紙
　　在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片,，瓊脂片等,。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC,，無色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量,。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。
　　2.7 膜過濾法
　　用特殊的濾膜過濾體積的含菌樣品,，經(jīng)丫叮橙染色,，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光,。
　　3. 間接測(cè)定法
　　微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量,，含糖量,，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多,，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值,。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來測(cè)定生物量,。
　　3.1 測(cè)定含氮量
　　大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%,，酵母為7.5%,，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25,，即可測(cè)定粗蛋白的含量,。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸,，過氯酸,，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法,。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合,，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)猓占诤粑?jì)中,，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量,。
　　3.2 測(cè)定含碳量
　　將少量（干重0.2~2.0 mg）生物材料混入1 mL水或無機(jī)緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鐘后冷卻,。加水稀釋至5 mL,，在580 nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值,，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照,，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　還原糖測(cè)定法
　　還原糖通常是指單糖或寡糖,，可以被微生物直接利用,，通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè),。方法是,，離心發(fā)酵液，取上清液,，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘,，取出加少許鹽酸酸化,，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液,，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn),，查表讀出還原糖的含量,。
　　3.4 氨基氮的測(cè)定
　　離心發(fā)酵液,，取上清液,，加入甲基紅和鹽酸作指示劑,，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛,，反應(yīng)數(shù)刻,，加入0.02 mol/L的使之變色,，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量,。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況,。
　　3.5 其他生理物質(zhì)的測(cè)定
　　P，DNA,，RNA，ATP,，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸,，產(chǎn)氣,，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)）,，耗氧,，黏度,，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定,。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，終產(chǎn)氣量,，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上,，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化,，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。
　　4. 商業(yè)化快速微生物檢測(cè)法
　　微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速,，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便,，自動(dòng)化,，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不同的檢測(cè)方法,，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備,，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：
　　4.1 試劑盒,，培養(yǎng)基等手段
　　抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題,，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基,，新型生化鑒定管,，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等,，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè),。
　　4.2 借助新型儀器
　　BACTOMETER全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù),，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（Impedance Technology）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi),，底部有一對(duì)不銹鋼電極,，測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變,。如微生物生長(zhǎng)時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子,，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量,。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù),，酵母菌，大腸桿菌群,，霉菌,，乳酸菌,，嗜熱菌,，革蘭氏陰性菌,，等。
　　微生物OD值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo),，OD是Optical Density（光密度）的縮寫,，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測(cè)定的范圍,，需要紫外分光光度計(jì)測(cè)大吸收波長(zhǎng),。用得多的是：505 nm測(cè)菌絲菌體、560 nm測(cè)酵母,、600 nm測(cè)細(xì)菌,。用測(cè)OD方法畫微生物生長(zhǎng)曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要,，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn),，就準(zhǔn)備10管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來測(cè)OD值就行了,。
　　一般測(cè)菌體密度的OD的波長(zhǎng)范圍是580 nm-660 nm,，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見光區(qū)（200 nm～400 nm為紫外光區(qū),，400 nm～800 nm為可見光區(qū)）,。空白如用水做,，需要離心洗滌菌體,；空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)以求條件一致,，后注意一般OD值在控制在0.1~0.4好,，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0,，一般要稀釋后再測(cè),，因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。
　　一般都測(cè)吸光值,，而且好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不成正比,，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性,。且取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)好,。
　　另,，用分光光度計(jì)測(cè)微生物的OD值為什么要把波長(zhǎng)設(shè)為600 nm
　　這個(gè)波長(zhǎng)其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏,。測(cè)吸收峰的實(shí)際意義并不大,，比如LB搖瓶培養(yǎng)過夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多納米處的吸收大,，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰,。