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核酸外切酶I(E.coli)試劑具有從3’-5’方向降解單鏈 DNA 的外切酶活性,，能夠逐步釋放脫氧核糖核酸5'單磷酸,，

并留下完整的5'端二核苷酸。該酶來(lái)源于攜帶有E. coli exo I 基因的質(zhì)粒,，經(jīng)重組表達(dá)純化而得,。Exonuclease I多用于PCR

擴(kuò)增后降解消化引物，該酶對(duì)于雙鏈DNA和磷?；蛞阴,；鶊F(tuán)封閉的3’OH末端DNA鏈無(wú)活性。

單位定義

1 單位指在 37℃ 條件下,，30 分鐘內(nèi)催化釋放 10 nmol 的酸溶性核苷釋放所需要的酶量,。

組分

名稱數(shù)量

Exonuclease I(20 U/μl)75 μl

10×ExoI Buffer1 ml

應(yīng)用

從PCR混合物中去除引物

PCR產(chǎn)物測(cè)序之前用于在單管中使用大引物進(jìn)行的PCR誘變反應(yīng)

從核酸混合物中去除含有3'羥基末端的單鏈DNA

檢測(cè)含有3'羥基末端的單鏈DNA的存在

儲(chǔ)存

置于-20°C，可保存3年,。

使用注意事項(xiàng)

（1）1×ExoI Buffer：67mM Glycine-KOH pH 9.5,，6.7mM MgCl2，10mM ,。該酶在常規(guī)PCR Buffer中也具有活性,。

（2）該酶的最佳反應(yīng)溫度為37°C，80°C 20min可失活,。

（3）該酶不能切割雙鏈DNA,，因此含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA需要變性后才能消化。

核酸外切酶I(E.coli)試劑恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03,，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試,。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,，1-6分別為1,、10、100,、1000、10e4和10e6Copies,，NTC為ddH2O為模板,。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果,，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試,。OG變色法為終點(diǎn)變色策略,，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管,，溶解管蓋上染料后,，陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色,，區(qū)分明顯,。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好,。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,，1-6分別為1、10,、100,、1000、10e4和10e6Copies,，NTC為ddH2O為模板,。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板,，1-6分別為1,、10 、100,、1000,、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板,。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前,，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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