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Klenow Fragment(exo-)試劑是DNA聚合酶I的N末端截短物,，它保留了DNA聚合酶活性，但5′-3′ 核酸外切酶活性缺失,。該酶進(jìn)一步經(jīng)點(diǎn)突變

（D355A,，E357A）去除了其 3′-5′的核酸外切酶活性。因此該DNA聚合酶無(wú)任何外切酶活性，僅包含了DNA聚合酶活性,，

廣泛用于標(biāo)記探針制備,、cDNA 第二條鏈的合成等建庫(kù)試驗(yàn)。

包裝

組分名稱(chēng)數(shù)量

Klenow Fragment(exo-) (10 U/μl)100 μl

*10×Klenow Buffer1 ml

*10×Klenow Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 °C), 50 mM MgCl2, 10 mM DTT. 該酶兼容PCR Buffer和內(nèi)切酶Buffer,。

單位定義

一個(gè)活力單位即在37°C條件下,，30分鐘內(nèi)催化10 nmol dNTP的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量,。

應(yīng)用

用隨機(jī)引物制備探針

隨機(jī)引物法標(biāo)記

cDNA 第二條鏈的合成

該酶不能用于產(chǎn)物平端不齊

儲(chǔ)存

-20°C可保存3年,。

失活

75°C,，20min失活。

Klenow Fragment(exo-)試劑恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03,，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng),。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,，1-6分別為1、10,、100,、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板,。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果,，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試,。OG變色法為終點(diǎn)變色策略,，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管,，溶解管蓋上染料后,，陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色,，區(qū)分明顯,。且該方法不受樣本類(lèi)型限制，雜質(zhì)耐受性很好,。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板,，1-6分別為1、10,、100,、1000、10e4和10e6Copies,，NTC為ddH2O為模板,。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板,，1-6分別為1,、10 、100,、1000,、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板,。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前,，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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