目錄:上海雅吉生物科技有限公司>>常規(guī)試劑>>試劑>> A06102×RAPA3G Multiplex PCR Mix試劑
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 1ml/10ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | A0610 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥,綜合 |
2×RAPA3G Multiplex PCR Mix試劑
Multiplex PCR 又稱多重 PCR,，是指在同一 PCR 反
應體系里加上兩對以上引物,，同時擴增出多個核酸片段的
PCR 反應，已被廣泛應用于科學研究和疾病診斷等多個領
域,，特別適用于微量樣本的多位點檢測,。
本制品使用具有擴增性能的熱啟動 RAPA3G DNA
聚合酶和優(yōu)化的多重 PCR 反應緩沖液，使其可有效擴增 20
重以上的 PCR,，具有的靈敏度,，程度上減少了反應
體系優(yōu)化步驟。
特性
? RAPA3G DNA 聚合酶,，擴增性能強,，抗雜質能力
? 封閉的熱啟動特性，50℃以下 100%無活性
? 優(yōu)化的反應緩沖體系,，避免非特異性擴增
? 高靈敏度,，有效擴增 0.1ng 的人基因組 DNA（20 重）
包裝
A0610A 1 ml
A0610B 1 ml ×10
儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年,；短期使用置
于 4°C（3 個月）保存,。
使用方法
1. 按下表配制反應體系并混合均勻：
2×RAPA3G Multiplex PCR Mix 12.5 μl
10×Primer Mix 2.5 μl
*模板 DNA 0.1~100 ng
ddH2O up to 25 μl
*模板 DNA：人的基因組 100 ng，質粒 100 pg,，cDNA 1-5 μl,。
2. PCR 擴增循環(huán)參數(shù)
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
預變性 95°C 5min
30-35Cycles
95°C 20s
57~60℃ 60s
72°C 2kb/min
末延伸 72°C 10min
請注意：該制品為熱啟動制品預變性步驟 5min 不可縮短，
否則 DNA 聚合酶無法恢復活性,。
3. 電泳：1kb 以內(nèi)的擴增產(chǎn)物建議使用 3%~4% 瓊脂糖凝
膠,，電壓使用 80V，可以有效的分離各擴增片段,。
4. 注意事項：
（1）當模板 GC 含量>70%時,，請?zhí)砑?5×Q-Solution（Cat.
No.: A3002）。
（2）推薦引物設計原則：引物長度保持在 22 - 30 bp,，擴增
產(chǎn)物長度在 2kb 以下,，GC 含量 50% - 60%，盡量減少各引
物之間 TM 的差值,。
（3）檢測單引物特異性：多重 PCR 反應前,，應對設計的引
物逐一擴增，以確定是否有非特異性擴增和擴增效率,。
（4）引物推薦使用濃度：推薦擴增片段<300bp 每條引物的
反應終濃度為 0.2-0.3μM,，擴增片段>300bp 每條引物的反
應終濃度為 0.05-0.15μM，如某些目標片段產(chǎn)量偏低或偏高,，
可適度調(diào)整其對應引物使用量以優(yōu)化反應結果,。
（5）反應前需將引物制成 10×Primer Mix：
引物儲存液 用量 10x 濃度
引物 1 F（100μM） 1 μl 1 μM
引物 1 R（100μM） 1 μl 1 μM
引物 2 F（100μM） 0.5 μl 0.5 μM
引物 2 R（100μM） 0.5 μl 0.5 μM
………….
引物 n F（100μM） 3 μl 3 μM
引物 n R（100μM） 3 μl 3 μM
ddH2O Upto 100μl
常見問題及解答：
1. 擴增產(chǎn)物少或沒有擴增,。
(1) 降低退火溫度（每個梯度降低 1℃）。
(2) 增加模板量
(3) 增加 PCR 循環(huán)數(shù),。
(4) 增加退火時間為 90 sec,，必要時可延長退火時間至 3
min。
(5) 增加引物使用量,。
2. 存在非特異性擴增,。
(1) 減少循環(huán)數(shù)，提高退火溫度（每個梯度降低 1℃）,。
(2) 減少引物使用量,。
(3) 重新設計引物。
3. 電泳時條帶模糊,。
(1) 減少循環(huán)數(shù)(每次減少 3 個循環(huán)),。
(2) 減少起始模板量。
(3) 延長延伸步驟時間至 15 - 30 min,。
(4) 減少退火時間,。
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