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細(xì)胞名稱：CHL倉鼠肺細(xì)胞ATCC

細(xì)胞代次：P4

細(xì)胞規(guī)格：T25瓶（包郵）/2冷凍管（需加干冰運(yùn)輸費(fèi)）

細(xì)胞凍存：無血清凍存液

細(xì)胞傳代：第一次建議1:2

細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶,，消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,，將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理,。顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù),，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好,。（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時要將蓋子擰松，傳代后建議一瓶用原瓶的培養(yǎng)基,，另外一瓶用自己配的培養(yǎng)基,，以便進(jìn)行對比培養(yǎng)）

培養(yǎng)步驟

細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時，將瓶裝的培養(yǎng)液收集至離心管中,，留5ml培養(yǎng)基,，放入37℃、5%CO₂孵箱培養(yǎng),；如果細(xì)胞密度超80%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代具體步驟如下細(xì)胞傳代：

A1,、對于懸浮細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄上清液,，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中,。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式,，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起,，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中,。

A2、懸浮細(xì)胞凍存：

1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，將T25 培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm

離心5min；

2,、棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml/支的雅吉生物無血清凍存液（C7001），混勻后加入凍存管中,。（如：凍一支,，加入 1ml 無血清凍存液即可）

3、將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可,；如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,，需在-80℃冰箱存

放 24 小時以上。

B1,、對于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考如下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 添加0.25%消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細(xì)胞，使之脫落后吸出,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基重懸,。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25瓶），補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,，最后放入到37℃,、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

B2,、貼壁細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2、添加0.25%消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min,；

3、 棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,，混勻后加入凍存管中。

細(xì)胞復(fù)蘇：

1,、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶,，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；

2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 培養(yǎng)基的15ml離心管中,，1000rpm離心5min,；

3、棄上清,，沉淀用5ml培養(yǎng)基重懸,，接種至T25培養(yǎng)瓶，放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4,、第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。

注意事項：有些細(xì)胞比較特殊,，如貼壁不牢，在運(yùn)輸過程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落,，這是正?，F(xiàn)象。請將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,，1000rpm離心5min,，收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)），沉淀加入消化液1-2ml,，輕輕吹打,，重懸，消化1-2分鐘后,，加5ml培養(yǎng)基終止反應(yīng),。再離心,，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基重懸,。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25）,，補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

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