細胞培養(yǎng)步驟
a,、細胞傳代：如果未超過80%匯合度時,，將瓶裝的培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml培養(yǎng)基,，放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%,，即可進行傳代培養(yǎng),，傳代具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上培養(yǎng)基終止消化,。
3.輕輕吹打細胞,，使之脫落后吸出，然后將懸液轉移至15ml離心管中,，在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基重懸,。
4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶）,，補充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,，最后放入到37℃,、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
b,、細胞凍存：
1,、細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次,；
2,、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min,；
3、 棄上清,，沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,，混勻后加入凍存管中。
4,、 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,，如后期要將細胞轉入液氮罐中，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉入液氮罐中,。
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