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基因敲除株的制備過程

閱讀：91 發(fā)布時間：2025-3-26

基因敲除株的制備方法有多種,，下面以 CRISPR - Cas9 技術(shù)為例,，介紹基因敲除株的一般制備過程：

確定靶位點：根據(jù)要敲除的基因序列，選擇合適的靶位點,。一般選擇基因的編碼區(qū),，尤其是起始密碼子附近或功能結(jié)構(gòu)域所在區(qū)域，以確保敲除后能有效破壞基因功能。
設(shè)計 gRNA 序列：針對選定的靶位點,，設(shè)計特異性的 gRNA 序列,。gRNA 通常長度為 20 個左右的核苷酸，需與靶 DNA 序列精確互補配對,，同時要避免與基因組中其他非靶區(qū)域有高度同源性,，以減少脫靶效應(yīng)。

選擇載體：挑選適合的表達載體,，如常用的質(zhì)粒載體,。載體應(yīng)包含能在宿主細胞中啟動 gRNA 和 Cas9 蛋白表達的啟動子，以及篩選標(biāo)記基因,，如抗生素抗性基因,，以便后續(xù)篩選陽性克隆。
插入 gRNA 和 Cas9 基因：將合成的 gRNA 序列和 Cas9 基因片段通過基因克隆技術(shù)插入到載體中,，構(gòu)建成完整的 CRISPR - Cas9 表達載體,。

轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化方法選擇：根據(jù)宿主細胞類型選擇合適的方法將表達載體導(dǎo)入細胞。對于動物細胞,，常用的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,、電穿孔法等；對于細菌或酵母細胞,，可采用化學(xué)轉(zhuǎn)化,、電轉(zhuǎn)化等方法。
轉(zhuǎn)染 / 轉(zhuǎn)化操作：按照所選方法的操作規(guī)程進行實驗,，將 CRISPR - Cas9 表達載體導(dǎo)入細胞,。在導(dǎo)入后，載體進入細胞并在細胞內(nèi)表達 gRNA 和 Cas9 蛋白,，gRNA 引導(dǎo) Cas9 蛋白識別并結(jié)合到靶基因位點,。

初步篩選：利用載體上的篩選標(biāo)記基因進行初步篩選。例如,，使用含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,，只有成功導(dǎo)入表達載體并表達出抗性蛋白的細胞才能存活，從而得到初步篩選的陽性細胞克隆,。
鑒定陽性克隆：通過 PCR 擴增靶基因區(qū)域,，然后進行測序分析，確定是否在靶位點發(fā)生了基因編輯,。只有在靶位點出現(xiàn)堿基缺失,、插入或替換等突變，導(dǎo)致基因功能喪失的克隆,，才是真正的基因敲除陽性克隆,。

單克隆分離：采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法等,，將篩選出的陽性細胞克隆進行單細胞分離培養(yǎng)，得到單個細胞衍生的克隆群體,，確保每個克隆均來自單個基因敲除細胞,。
進一步鑒定：對單克隆細胞進行再次鑒定，除了通過測序驗證基因敲除情況外,，還可采用 Western blot,、免疫熒光等方法檢測基因敲除后蛋白表達水平的變化，以確認基因敲除的效果,。

胚胎注射：如果要制備基因敲除動物模型,，如小鼠，可將 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)注射到受精卵中,。通過顯微操作技術(shù),，將含有 gRNA 和 Cas9 蛋白或 mRNA 的溶液注射到受精卵的原核或細胞質(zhì)中，然后將注射后的受精卵移植到代孕母鼠的輸卵管中,，讓其發(fā)育成胚胎,。
基因敲除動物鑒定：待幼鼠出生后，通過提取鼠尾基因組 DNA,，采用 PCR 和測序等方法鑒定基因敲除情況,，篩選出基因敲除陽性的動物個體，即得到基因敲除株動物模型,。
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