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腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是指從腫瘤組織中分離出腫瘤細(xì)胞,，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境使其生長(zhǎng),、增殖的技術(shù)。以下是腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法：

培養(yǎng)前準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)器材：準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)瓶,、培養(yǎng)皿,、移液管、離心管,、顯微鏡,、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等,。所有器材需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的清洗,、消毒和滅菌處理，以防止微生物污染,。

培養(yǎng)基：根據(jù)腫瘤細(xì)胞的類型選擇合適的培養(yǎng)基,，如 RPMI - 1640、DMEM 等,。培養(yǎng)基中通常需添加 10% - 20% 的胎牛血清,，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。此外,，還需加入青霉素,、鏈霉素等抗生素，以防止細(xì)菌污染,，其終濃度一般為青霉素 100 U/mL,、鏈霉素 100 μg/mL。

消化液：常用的消化液為胰蛋白酶 - EDTA 混合液,。一般胰蛋白酶的濃度為 0.25%,，EDTA 的濃度為 0.02%。

細(xì)胞取材與分離

取材：在無(wú)菌條件下,，從手術(shù)切除的腫瘤組織中獲取標(biāo)本,。盡量選取腫瘤邊緣生長(zhǎng)活躍的部分，避免取到壞死灶,。將取下的組織放入含有預(yù)冷的,、含抗生素的 PBS 緩沖液的無(wú)菌容器中，盡快送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理,。

分離：將腫瘤組織在超凈工作臺(tái)上用 PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，去除血液和雜質(zhì),。然后將組織剪成 1 - 2 mm3 的小塊,，加入適量的消化液，在 37℃恒溫箱中消化 15 - 30 分鐘，期間輕輕搖晃容器,，使組織塊與消化液充分接觸,。當(dāng)組織塊變得松散，大部分細(xì)胞解離下來(lái)時(shí),，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化,。通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織塊,，然后將細(xì)胞懸液離心,，轉(zhuǎn)速一般為 1000 - 1500 rpm，離心 5 - 10 分鐘,，棄去上清液,，得到腫瘤細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞培養(yǎng)

接種：用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,，調(diào)整細(xì)胞密度,，一般為 1×10? - 1×10?個(gè) /mL。將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,，輕輕搖勻,，使細(xì)胞均勻分布。然后將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中,，在 37℃,、5% CO?的條件下培養(yǎng)。

換液：培養(yǎng)過(guò)程中,，細(xì)胞會(huì)消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，并產(chǎn)生代謝廢物。因此,，需要定期更換培養(yǎng)基,，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境。一般每隔 1 - 2 天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并更換培養(yǎng)基,。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)到 80% - 90% 時(shí),，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

消化：吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基,，用 PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞 1 - 2 次,，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入適量的消化液,，覆蓋細(xì)胞表面,，在 37℃下消化 1 - 3 分鐘。當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,、間隙增大時(shí),，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。

吹打與接種：用移液管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來(lái),，形成細(xì)胞懸液,。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心,，轉(zhuǎn)速和時(shí)間與初次分離細(xì)胞時(shí)相同,。棄去上清液，用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，然后按照一定的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中,，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到一定數(shù)量時(shí),，為了長(zhǎng)期保存細(xì)胞,，需要進(jìn)行凍存。將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,，離心后棄去上清液,，加入適量的凍存液（一般為含 10% DMSO、20% 胎牛血清的培養(yǎng)基）,，使細(xì)胞密度為 1×10? - 1×10?個(gè) /mL,。將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，密封好,，然后按照一定的降溫程序進(jìn)行凍存,，一般先在 4℃冰箱中放置 30 分鐘，再放入 - 20℃冰箱中放置 1 - 2 小時(shí),，最后放入 - 80℃冰箱中過(guò)夜,，次日轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管,，迅速放入 37℃水浴鍋中,，輕輕搖晃，使其在 1 - 2 分鐘內(nèi)快速解凍,。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中,，加入適量的培養(yǎng)基，離心,，棄去上清液,，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中,，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。