豬藍耳熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬藍耳熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱： Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，定性檢測豬藍耳病病毒，對豬藍耳病病毒的診斷及療效評估有重要指導意義,。
【原 理】
本試劑盒針對豬藍耳病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,，在反應體系中含豬藍耳病病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【試劑盒組成】
序號 | 組成 | 50T/盒 |
1 | PRRSV RT-PCR反應液 | 875 μL×1管 |
2 | PRRSV 混合酶液 | 125 μL×1管 |
3 | PRRSV陽性對照 | 40 μL×1管 |
4 | PRRSV陰性對照 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水,，陽性對照為含豬藍耳靶基因的質(zhì)粒,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,，有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。
2.肺臟,、淋巴結(jié)和脾臟樣品：取樣本20 g，加少量滅菌PBS,，用無菌研磨器研磨至糊狀,，再用4倍體積的PBS稀釋成乳劑，8000 rpm 4℃離心10 min,，取上清待檢,。
3.應避免標本間交叉污染。
4.樣本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃以下,，避免反復凍融,。。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表 | RT-PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶 | 2.5 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管,。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μL,、終體積25 μL/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μL/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增,。
反應體積 | 25μL | 通道選擇 | FAM通道采集豬藍耳病病毒信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
+ | 標本中檢出豬藍耳病病毒 |
- | 標本中未檢出豬藍耳病病毒 |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果,。
2. 被檢樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集,、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果,。
【產(chǎn)品性能指標】產(chǎn)品的低檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%,。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室,，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理,；
3. 各區(qū)域物品均為專用,，不得交叉使用，以免污染,；檢測結(jié)束后,，應立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應液時,，應盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確,；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心,；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾,，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭,，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應管，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒,；
9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用。
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