H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備
一.試劑準(zhǔn)備
1)hESC/iPSC培養(yǎng)基配制(500 mL)
1. 在4條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B,，勿在37培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍,。
2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC培養(yǎng)基,，之后置于4儲存,，封口膜封好后2周內(nèi)使用。
3. 有初培養(yǎng)需擴(kuò)建的需求,，建議先配置100 mL,保證2周內(nèi)使用完畢,。
2)Matrigel鋪板(以貨號為354277的Corning Matrigel包被6孔板為例)
A. 分裝 Matrigel
1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度,，而是以Dilution Factor表示,，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板,，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98,。
2. 準(zhǔn)備18個無菌1.5 mL EP管，標(biāo)記Matrigel日期,、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架,，均置于-20冰箱中預(yù)冷1小時,。
3. 將Matrigel放置4冰箱過夜解凍，當(dāng)Matrigel解凍即可開始分裝,。
注：在解凍時,，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近,。
4. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒,，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架,、1mL吸頭放置于生物安全柜上,。
5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中,，并置于冰上,。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時需要更換吸頭。
6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20冰箱中保存,。
B. 鋪板
1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中,，準(zhǔn)備4個6孔板，標(biāo)記Matrigel,、批號,、日期和操作人。
2. 1 mL無菌吸頭置于-20冰箱中預(yù)冷1小時,，取出一支冷凍的Matrigel(5mL)置于4冰箱解凍至化凍,。
3. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel,、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上,。
4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。
5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12,，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻,。
6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻,。
7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用,，或置于4冷藏過夜，兩周內(nèi)使用,。
H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)H1人胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇步驟(以6孔板為例)
1. 將水浴鍋預(yù)熱至37,；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(15~30),。
2. 取4 mL hESC/iPSC培養(yǎng)基,，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(15~30),。
注意：不要在37水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基,。
3. 取出1支冷凍的細(xì)胞置于37水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍,，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將消失時取出,。
4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的15 mL 離心管中,，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12,，過程中輕柔晃動混勻細(xì)胞，160g離心5 min,。
5. 吸棄上清,，加入預(yù)溫的4 mL的hESC/iPSC培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細(xì)胞懸液，盡量避免吹打,。
注：可留20 μL上清液,，輕彈管底，使細(xì)胞懸浮液更均勻,，避免成較大細(xì)胞團(tuán),。
6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細(xì)胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中,。
7 水平十字搖勻三次,，置于37，5% CO2濃度,，飽和濕度的培養(yǎng)箱中,，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。
8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC培養(yǎng)基,，之后每天更換培養(yǎng)基,。
注：在hESC(H1)培養(yǎng)過程中，如果細(xì)胞的匯合度超過50%,，建議更換培養(yǎng)基時,，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。
培養(yǎng)容器(孔數(shù))底面積DPBS (mL)EDTA傳代工作液hPSC培養(yǎng)基*
2)H1人胚胎干細(xì)胞傳代步驟(以6孔板為例)
1. 傳代條件：① H1人胚胎干細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示),，一般情況下每3-4天傳代;
② H1人胚胎干細(xì)胞匯合度較低,，生長密度分布不均勻。
注：即使克隆團(tuán)較小,、匯合度不足,，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。
2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進(jìn)行傳代,，如果細(xì)胞正常,，克隆團(tuán)匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示),，建議按照1:8進(jìn)行傳代,，如果密度偏低,，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例,。
注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例),。
3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25),。
4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基,，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫(~25),。
5. 將 Matrigel 包被的6孔板,，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25)。
6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備2 mL/孔的hESC/iPSC培養(yǎng)基,，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C,，恢復(fù)至室溫(~25)。
7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取,，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂),，輕輕搖晃并吸取。
8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底,。
9. 置于37培養(yǎng)箱中孵育8-9 min,。
注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓,，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化,，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時間;
② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸,，使6孔板受熱均勻,，不要疊放。
10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜,，避免震蕩搖晃細(xì)胞,，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
11. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C,，水平十字搖晃6孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì),。
注：① 加hESC/iPSC培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細(xì)胞1-2次,，不能超過2次,，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象,，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時間(< 10min)。
②hESC(H1)細(xì)胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細(xì)胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板),。
12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液,，加入預(yù)溫的hESC/iPSC培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。
13. 在6孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱,、代次,、傳代比例、日期,、操作人。將步驟9獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻,，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中,。
注：為了鋪板均勻并降低對細(xì)胞的損傷，可以將步驟9獲得的細(xì)胞懸液收集至2mL離心管,，輕柔顛倒混勻細(xì)胞1-2次;再按照傳代比例接種,。
14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次,，置于37,，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中,， 再次水平十字搖勻6孔板三次,，培養(yǎng)過夜。
15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC培養(yǎng)基,，此后每天換液,，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。
3)H1人胚胎干細(xì)胞凍存步驟(以6孔板為例)
1. 當(dāng)H1人胚胎干細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存,，一般6孔板每孔可凍存1管,。
2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱,、代次(P#),、日期、操作人,。
3. 取出4冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution,，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻,。
4. 吸取上清液,，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次,，再吸取,。
5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細(xì)胞置于37培養(yǎng)箱中，計時8-9 min(可參考“六,、傳代hESC/iPSC"步驟),。
6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板,，吸取hESC/iPSC Passage Solution,。
7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液,，輕柔吹打,，水平十字搖勻3次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中,。
8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中,，并置-80冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存,。
H1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時需避免的操作失誤
1.細(xì)胞培養(yǎng)時要規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)
通常培養(yǎng)細(xì)胞時會出現(xiàn)污染等問題很大程度原因是由于我們在培養(yǎng)細(xì)胞時操作方法不夠標(biāo)準(zhǔn)沒有處理好所造成的,，因此在培養(yǎng)細(xì)胞時需要加強(qiáng)操作規(guī)范。
(1)嚴(yán)格控制無菌操作,。在培養(yǎng)設(shè)備和耗材都準(zhǔn)備好以后就要做好日常的消毒工作嚴(yán)格控制細(xì)菌,、真菌、微生物等常見的污染,。如果條件有限的情況下可以在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目股貋矸乐刮廴镜沁@往往會影響到細(xì)胞的培養(yǎng)因此要謹(jǐn)慎,。
(2)培養(yǎng)環(huán)境需要每日觀察。特別是很多細(xì)胞培養(yǎng)時都會在培養(yǎng)箱中進(jìn)行,，其中溫度,、適度以及二氧化碳的濃度都會有嚴(yán)格的要求，如果在培養(yǎng)時設(shè)備中的環(huán)境出現(xiàn)了偏差那么細(xì)胞培養(yǎng)時自然會出現(xiàn)問題,，因此在培養(yǎng)時應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格檢測好培養(yǎng)設(shè)備及環(huán)境,。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的選擇。培養(yǎng)時會用到培養(yǎng)基,、血清,、試劑等物品但是選擇的產(chǎn)品應(yīng)該是優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，劣質(zhì)的產(chǎn)品往往技術(shù)不過關(guān)其中包含很多有害物質(zhì)因此不建議不夠,。
H1人胚胎干細(xì)胞注意事項
1. 收到H1人胚胎干細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象,，干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞檢查干冰是否揮發(fā),，細(xì)胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系,。
2. 仔細(xì)閱讀H1人胚胎干細(xì)胞說明書,，了解細(xì)胞相關(guān)信息,，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基,、血清比例,、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致,，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題,，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。
3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng),。
4. 建議客戶復(fù)蘇細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流,。由于運(yùn)輸?shù)脑?，?xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系,，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決,。
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