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人膀胱癌細(xì)胞5637

培養(yǎng)說明書

一,、細(xì)胞培養(yǎng)條件

二,、細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶,，消毒后放到超凈臺內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,，將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理,。顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù),，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好,。（傳代后建議一瓶用原瓶的培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的培養(yǎng)基,，以便進(jìn)行對比培養(yǎng),，換液后將瓶蓋擰松）

三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a,、細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時,，將瓶裝培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml培養(yǎng)基,，放入37℃,、5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),，傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細(xì)胞，使之脫落后吸出,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基重懸,。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25瓶），補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,，最后放入到37℃,、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

b,、細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心 5min；

3,、 棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001），混勻后加入凍存管中,。

4,、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可，如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,，則需在-80℃冰箱 中存放24小時以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中,。

C、細(xì)胞復(fù)蘇：

1,、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,，快速將其置入 37℃水浴中解凍,， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；

2,、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3,、棄上清，沉淀用5ml培養(yǎng)基重懸,，接種至T25培養(yǎng)瓶,，放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4,、第二天,，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

四,、注意事項：有些細(xì)胞貼壁不牢,，在運(yùn)輸過程中容易發(fā)生細(xì)胞脫落，這是正?，F(xiàn)象,。如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min,，收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打,，重懸,，消化1-2分鐘后，加5ml培養(yǎng)基終止反應(yīng),。再離心,，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基重懸,。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個T25）,，補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

五,、售后條款：

1）細(xì)胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些,？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

1. 細(xì)胞運(yùn)輸途中遭遇的各種問題，細(xì)胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等,，重發(fā)；

2. 細(xì)胞污染問題,，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi),，給我們提出真實的實驗結(jié)果，核實后重發(fā),；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時后,，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片）,，重發(fā),；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

5. 細(xì)胞活性問題,，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，核實后予重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格,。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的，并跟技術(shù)人員溝通的,，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā)。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費(fèi)重發(fā),。

2）細(xì)胞出現(xiàn)問題,，不予以重發(fā)的情況有哪些？

1. 客戶造成細(xì)胞污染,，不重發(fā),；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā),；

3. 非本庫推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好,，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā)；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的,，不重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi),，未告知，不重發(fā),；

7. 視具體情況而定,。