細胞復(fù)蘇技巧,，MDL科研助手來支招
細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖,，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以是單個細胞,，也可以是細胞系,。細胞復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，下面小編具體給大家介紹下細胞復(fù)蘇的protocal和注意事項,！
01,、細胞復(fù)蘇的原理
細胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養(yǎng)，細胞恢復(fù)生長的過程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時,，細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常,，生化反即刻恢復(fù)。細胞復(fù)蘇過程升溫要快,，原則是慢凍快融,，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶,，影響細胞存活,。
02、細胞復(fù)蘇的實驗步驟
1. 從液氮罐中取出凍存管,，置于-80℃冰箱數(shù)分鐘，迅速放入37℃水浴鍋中,，不時搖動,，使其在2min內(nèi)急速融化，注意不要把凍存管的管口沒入水浴中避免引起污染,，復(fù)蘇過程中一般細胞死亡率在25%左右,；
2. 融化后，凍存管用75％酒精擦拭冷凍管外殺菌后,，打開蓋子,，取出凍存管的細胞懸液，緩慢加入到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中,，37℃,、5%CO培養(yǎng)。如果細胞需要去除冷凍保護劑,，用移液槍將細胞懸液注入15mL無菌離心管中,，
再加5ml培養(yǎng)基，根據(jù)細胞類型選擇合適的離心速度,，低速離心5min,，棄去上清，加入2-3mL預(yù)熱的培養(yǎng)基,，輕輕吹勻,，保證細胞重懸；
3. 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后,，將重懸的細胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中,，37℃、5%CO培養(yǎng),，24h后,，更換新鮮培養(yǎng)基，去除死細胞，三天可進一次換液,，當(dāng)細胞長到有80-90%匯合進行傳代,。
03、細胞復(fù)蘇的注意事項
1. 取凍存細胞時應(yīng)做好防護措施,，戴好防凍手套,，護目鏡。如果凍存管密封不嚴(yán),，液氮可被吸入,。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸,。
2. 細胞放入水浴中復(fù)蘇時注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動,，使其受熱均勻，且速度越快越好,，這樣可以最大限度的保存細胞活力,，并防止水浴鍋的水進入細胞凍存管造成細胞污染。
3. 打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏?。注意無菌操作,，細胞復(fù)蘇后的操作在4℃冰盒中進行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性,。
4. 解凍時間在2min以內(nèi)完成,，且整個過程盡量避免吹打細胞產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致細胞復(fù)蘇后的生長狀態(tài)不佳,。
5. 復(fù)蘇細胞的時候盡量避免凍存管接縫處沾水,，防止支原體污染，實驗室定期用過氧化氫熏蒸,，細胞小黑點增多時用支原體檢測試劑盒檢測,，并且及時清除。
04,、如何避免凍存管爆炸
1. 選擇質(zhì)量好的進口內(nèi)旋凍存管,，擰緊蓋子，防止液氮進入管內(nèi),，液氮罐的細胞留種用,，平時常用的細胞放在-80冰箱。
2. 凍存細胞時盡量加多一點凍存液,，比如2ml凍存管加1.8ml凍存液,，保留少量空間。
3. 取細胞時帶好手套和防護眼鏡,，準(zhǔn)備好鑷子,，避免手直接接觸凍存管造成手凍傷或炸傷,。
4. 從液氮里取出細胞時，先在液氮罐上面的蒸汽里放一會,，然后再拿出來,，將凍存盒殘余的液氮流到罐內(nèi)，避免拿出時凍傷,，也避免細胞從液氮迅速升到室溫發(fā)生爆炸,。
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