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人類轉(zhuǎn)移性黑色素瘤A2058培養(yǎng)說明書

一,、細(xì)胞培養(yǎng)條件

二,、細(xì)胞收到后處理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是細(xì)胞運輸?shù)霓k法,。收到細(xì)胞回到自己的實驗室后，先打開外包裝,，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內(nèi),，嚴(yán)格無菌操作，培養(yǎng)箱靜置2-4小時,。鏡下觀察：未超過80%匯合度時,，可將瓶裝的培養(yǎng)液收集至離心管中，加入6ml培養(yǎng)基,，放入37℃,、5%CO2孵箱培養(yǎng)；超過80%匯合度時,，根據(jù)情況傳代或者凍存,，具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。（注意發(fā)貨的是密封培養(yǎng)瓶的話,，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)記得培養(yǎng)瓶蓋子擰松）

三,、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻,。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中）,，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

1、對于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細(xì)胞,，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液,，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。

PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞,，收到細(xì)胞后,，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作,；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿,，加入5ml左右培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%,，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存,。若密度超過80%,，可直接進(jìn)行傳代（方法同上）。

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3）細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次,；2,、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3,、用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中,；

4,、先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃,。

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四,、售后服務(wù)告知書

1）細(xì)胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些,？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么,？

1. 細(xì)胞運輸途中遭遇的各種問題，細(xì)胞丟失,、瓶身破損,、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā),；

2. 細(xì)胞污染問題,，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi)，給我們提出真實的實驗結(jié)果,，核實后重發(fā),；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后,，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活,，（需提供真實清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片），重發(fā),；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時候并且未開封,，出現(xiàn)污染，重發(fā),；

5. 細(xì)胞活性問題,，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力,，核實后予重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照，3天未告知的,，視為產(chǎn)品合格,。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的,，重發(fā),。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā)。

二）細(xì)胞出現(xiàn)問題,，不予以重發(fā)的情況有哪些,？

1. 客戶造成細(xì)胞污染，不重發(fā),；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā)；

3. 非本庫推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好,，不重發(fā),；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的,，不重發(fā),；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的，不重發(fā),；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi),，未告知，不重發(fā),；

7. 視具體情況而定,。 

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