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試劑,、試劑盒激酶緩沖液MgCl2二硫蘇糖醇牛血清白蛋白ddH20TE 緩沖液EDTA聚核苷酸激酶引物放射性化合物

儀器,、耗材放射性化合物離心機(jī)和轉(zhuǎn)子丙烯酸防護(hù)板離心管架廢棄物容器蓋革計(jì)數(shù)器QuickSpin 柱

實(shí)驗(yàn)步驟

一、材料

1. 緩沖液,、溶液和試劑

5X 激酶緩沖液

0.25mol/LTris-HCl,pH9

0.05mol/LMgCl2

0.05mol/L 二硫蘇糖醇（DTT)

0.25 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA)

-20°C 儲(chǔ)存

滅菌重蒸水（ddH20)

TE 緩沖液,，pH8.0

10 mmol/LTris-HCl,pH8.0

1mmol/LEDTA,，pH8.0

2. 酶和酶緩沖液

聚核苷酸激酶，10U/ul(Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

4. 放射性化合物

[y-32P]ATP6000Ci/mmol/L(lCi=3.7X1010Bq)(PerkinElmerLifeSciences)

也可用 [y-33P]ATP, 它相對(duì)于 [y-32P]ATP 危險(xiǎn)性稍微小一些,，并具有更長(zhǎng)的半衰期,，但是更貴。

5. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)子

用翻轉(zhuǎn)吊桶式轉(zhuǎn)子離心,，15 ml 錐形管的適配器

6. 專(zhuān)用設(shè)備

丙烯酸防護(hù)板,、離心管架（「betablock」）和廢棄物容器

離心管架（例如 3008-1000fromUSAScientific)

收集管（1.5 ml，包括快速離心柱）

冷卻塊（coolingblock)

錐形管,，15 ml

蓋革計(jì)數(shù)器（Geigercounter,—種放射能測(cè)定器）

離心管,，0.5 ml，滅過(guò)菌

QuickSpin 柱（TE：),G-25 葡聚糖凝膠（Sephadex) 柱,，用于放射性標(biāo)記 DNA 的純化(Roche)

水浴

二、方法

1. 用滅菌 ddH20 將引物稀釋至10umol/L,。所購(gòu)買(mǎi)的引物是以 50nmol/L 等級(jí)合成的收到時(shí)呈凍干粉狀,。用 PH8.0 的 TE 緩沖液將干粉溶解后，作為儲(chǔ)存液保存,。使用前將其稀釋成 10umol/L 的工作溶液,，分裝成小份，凍存于-20°C,。

2. 選擇一個(gè)引物進(jìn)行末端標(biāo)記,。在冰上融化引物和 5X 激酶緩沖液。酶在加入反應(yīng)體之前都要放在冰柜里,，也可以用臺(tái)式冷卻塊使酶維持在-20°C,。在室溫下融化同位素，需將丙烯酸防護(hù)板擋在前面,。

3. 在冰上將 3ul 滅菌 ddH20,、5.6ul5X 激酶緩沖液、12ul 10mol/L 引物和 1.4ul 聚苷酸激酶加入到滅菌的 0.5 ml 離心管中,，將冰盒放在丙烯酸防護(hù)板后面,，加入 6ul[y-32P] ATP(6000Ci/mmol/L)?；靹?，蓋上蓋子，37°C 水浴上溫育 1~2 h,。

4. 在溫育的最后 10min 準(zhǔn)備 QuickSpin 柱,。將柱子反復(fù)顛倒混勻，除去管帽和頂蓋放入收集管內(nèi),。將柱子/收集管組件置于 15 ml 錐形管中,，在臺(tái)式離心機(jī)中以 1100 g 離心2 min。倒干收集管再離心一次。在裝入末端標(biāo)記的反應(yīng)混合物之前,，轉(zhuǎn)移柱到另一干凈的收集管中,。

5. 溫育完成之后，將末端標(biāo)記反應(yīng)混合物在離心機(jī)上短暫離心,。加入 52ul 滅菌 ddH20,移液器吹打混勻,，轉(zhuǎn)移所有溶液到離心柱上純化（比如除去未利用的核苷酸)。

6.1100 g 離心 4 min,。

7. 從收集管上將柱子取下,，并扔入適當(dāng)?shù)姆派湫詮U棄物容器中。蓋上收集末端標(biāo)記物的收集管的蓋子,。繼續(xù) PCR 方案（方案 2) 或?qū)⒁锓旁谠嚬芗苌嫌?20°C 凍存,。