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總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒

(NBT核黃素比色法)

一、產(chǎn)品簡介：

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶,，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,；由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基,，壽命極短，SOD活性一般用間接方法測定,，并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD活力,，其中顯色劑有NBT(四氮唑藍)、WST-1、WST-8等,。

雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應(yīng),，通過比色來檢測組織、細(xì)胞,、植物,、血清或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒，其檢測原理是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小,。在有氧化合物存在的情況下,，核黃素被光還原，后經(jīng)一系列的反應(yīng)可將NBT還原為藍色的甲臜(formazan),，后者在560nm處有強吸收,，SOD可清除超氧陰離子(O2.-),，從而抑制了甲臜的形成,，反應(yīng)液藍色愈深說明超氧化物岐化酶活性愈低，反之則酶活性愈高,，據(jù)此通過比色分析就可以計算出超氧化物岐化酶活性水平,。

該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途,。

二,、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

生理鹽水或PBS

離心機,、離心管,、小試管

分光光度計、比色杯

水浴鍋或恒溫箱

四,、操作步驟(僅供參考)：

1,、 準(zhǔn)備樣品：

①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測,，如超過檢測范圍,，用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液,，顛倒混勻,，取至少500μl全血，4℃ 3000g離心5min,，轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml離心管中,，適量生理鹽水稀釋后待測；亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,，如Leagene ACK紅細(xì)胞裂解液等,。

②組織樣品：動物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿,，4℃ 4000g離心10min,，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。

③細(xì)胞樣品：對于貼壁細(xì)胞,，由于后續(xù)用于酶活性的測定,，避免使用胰酶消化細(xì)胞?？梢允褂眉?xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞并收集細(xì)胞,，細(xì)胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次，按照每10⁶細(xì)胞加入300～500μl SOD提取液的比例,，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿,，4℃ 10000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定,。

④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g,，剪碎，置于4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中,，加入預(yù)冷提取液1ml,，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管,，加提取液至總體積為4ml,，4℃ 10000r/min離心20min，上清液為酶提取液,，上清液可用于SOD的檢測,。注意：如果SOD酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取液的總體積,，以便提高SOD酶的濃度,。

⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大,，該活力范圍僅作為初步的參考),；每種樣品準(zhǔn)備20～100μg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量,，用該試劑盒提供的SOD提取液適當(dāng)稀釋樣品,，例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10～100倍,，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定,，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定,，可以-20℃凍存,，但建議盡量當(dāng)天完成測定,。

2、 配制NBT酶工作液：按照每個反應(yīng)1.6ml的體積,，均勻混合1ml SOD提取液,、0.3ml NBT顯色液、0.3ml酶溶液,，即可配置成1.6ml NBT酶工作液,，根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的NBT酶工作液,。具體配置方法可以參考下表,，配制好的NBT酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用,，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用,。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下,，然后適當(dāng)混勻后再使用,。

3、 (選做)準(zhǔn)備SOD標(biāo)準(zhǔn)品：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品,，用本試劑盒提供的SOD提取液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200,、100、50,、20、10,、5,、2U/ml，各取20μl參考樣品進行檢測,。注意：為避免稀釋后SOD酶活性的下降,， SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用，該試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品,，但可使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考

4,、 SOD加樣：參考下表使用小離心管或試管設(shè)置空白對照管、光照對照管,、測定管,。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入反應(yīng)啟動工作液后充分混勻,。注意：加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始,，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

5,、 SOD測定：混勻,，取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應(yīng)20min，各管受光情況應(yīng)一致,，溫度高時時間縮短,，低時延長；反應(yīng)結(jié)束后以不照光的空白對照管調(diào)零,，用分光光度計或酶標(biāo)儀測定560nm處吸光度,，如果用分光光度計，比色杯光徑1cm,，加入的上清量因根據(jù)比色杯的最小量程而定,。

五、計算結(jié)果：

SOD活力單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U),。

液體中總SOD活力(U/ml)=(A_光照－A_測定)/(50%×A_光照×V_T)

組織,、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A_光照－A_測定)×V/(50%×A_光照×V_T×W)

血液中總SOD活力(U/gHb)=(A_光照－A_測定)×V×C/(50%×A_光照×V_T×Hb)

式中：A_光照=光照對照管的吸光度

         A_測定=測定管的吸光度

         V=樣品液總體積(ml)

          V_T=測定時樣品所用體積(ml)

          W=樣品鮮質(zhì)量(g)

          C=1ml/采血量(ml)

          Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)

六、注意事項:

1,、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融,，以免失效或效率下降。

2,、 待測樣品-70℃可保存1個月,，需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。

3,、 細(xì)胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液,，否則會干擾本試劑盒的檢測。

4,、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾,，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高,。

5,、 對于植物樣品，研磨處理應(yīng)迅速,，以免SOD酶活下降,，盡量處于冰浴狀態(tài)處理。

6,、 如果無4000Lx日光,，可200W在10~12cm處垂直照射20min；在超凈工作臺5cm垂直照射30min左右,；在強太陽光下垂直照射30min左右,。

7、 一般要求各管受光情況一致,，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈管平行的直線上,。

8,、 反應(yīng)溫度控制在25℃，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間,；溫度較高時,，光照時間應(yīng)縮短；溫度較低時,，光照時間相應(yīng)延長,。

9、 所用離心管或試管應(yīng)潔凈透明,，透光性好,。

10、 如果配制的NBT酶工作液出現(xiàn)淡黃色沉淀或絮狀物應(yīng)棄用,，否則效果不佳,。

11、 如果用酶標(biāo)儀,，96孔板每孔應(yīng)加20μl上清液,，相應(yīng)檢測的次數(shù)大大增加。

12,、 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

七,、有效期∶6個月有效,。