總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒
(NBT核黃素比色法)
一、產(chǎn)品簡介:
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶,,能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,,生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2),是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,;由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基,,壽命極短,SOD活性一般用間接方法測定,,并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD活力,,其中顯色劑有NBT(四氮唑藍(lán))、WST-1,、WST-8等,。
雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應(yīng),通過比色來檢測組織,、細(xì)胞,、植物、血清或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒,,其檢測原理是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小,。在有氧化合物存在的情況下,核黃素被光還原,后經(jīng)一系列的反應(yīng)可將NBT還原為藍(lán)色的甲臜(formazan),,后者在560nm處有強(qiáng)吸收,,SOD可清除超氧陰離子(O2.-),從而抑制了甲臜的形成,,反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明超氧化物岐化酶活性愈低,,反之則酶活性愈高,,據(jù)此通過比色分析就可以計算出超氧化物岐化酶活性水平,。
該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,不適用于臨床診斷或其他用途,。
二,、產(chǎn)品組成:
名稱 | 50T | 100T | Storage |
試劑(A): SOD提取液 | 250ml | 2×250ml | RT |
試劑(B): NBT顯色液 | 15ml | 30ml | -20℃ 避光 |
試劑(C): 酶溶液 | 15ml | 30ml | -20℃ 避光 |
試劑(D): 反應(yīng)啟動液 | 10ml | 20ml | 4℃ |
三、自備材料:
生理鹽水或PBS
離心機(jī),、離心管,、小試管
分光光度計、比色杯
水浴鍋或恒溫箱
四,、操作步驟(僅供參考):
1,、 準(zhǔn)備樣品:
①血漿或含紅細(xì)胞的樣品:從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血,如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測,,如超過檢測范圍,,用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下:用抗凝管收集血液,,顛倒混勻,,取至少500μl全血,4℃ 3000g離心5min,,轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml離心管中,,適量生理鹽水稀釋后待測;亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,,如Leagene ACK紅細(xì)胞裂解液等,。
②組織樣品:動物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例,,用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿,,4℃ 4000g離心10min,取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定,。
③細(xì)胞樣品:對于貼壁細(xì)胞,,由于后續(xù)用于酶活性的測定,避免使用胰酶消化細(xì)胞,??梢允褂眉?xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞并收集細(xì)胞,細(xì)胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次,按照每106細(xì)胞加入300~500μl SOD提取液的比例,,用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿,,4℃ 10000g離心10min,取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定,。
④植物樣品:準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g,,剪碎,置于4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中,,加入預(yù)冷提取液1ml,,低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管,用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管,,加提取液至總體積為4ml,,4℃ 10000r/min離心20min,上清液為酶提取液,,上清液可用于SOD的檢測,。注意:如果SOD酶活性較低,應(yīng)相應(yīng)減少提取液的總體積,,以便提高SOD酶的濃度,。
⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度,通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大,,該活力范圍僅作為初步的參考),;每種樣品準(zhǔn)備20~100μg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測,根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量,,用該試劑盒提供的SOD提取液適當(dāng)稀釋樣品,,例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清,通常需要稀釋10~100倍,,準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定,,可以冰浴保存;如果當(dāng)天不能完成測定,,可以-20℃凍存,,但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2,、 配制NBT酶工作液:按照每個反應(yīng)1.6ml的體積,,均勻混合1ml SOD提取液、0.3ml NBT顯色液,、0.3ml酶溶液,,即可配置成1.6ml NBT酶工作液,根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量,,配置適量的NBT酶工作液,。具體配置方法可以參考下表,,配制好的NBT酶工作液4℃或冰浴保存,可以在當(dāng)天使用,,但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用,。注意:由于酶溶液的用量較少且易沉降,必須注意在使用前先輕輕離心一下,,然后適當(dāng)混勻后再使用,。
加入物(ml) | 1次 | 10次 | 20次 |
SOD提取液 | 1.0 | 10 | 20 |
NBT顯色液 | 0.3 | 3 | 6 |
酶溶液 | 0.3 | 3 | 6 |
NBT酶工作液 | 1.6 | 16 | 32 |
3、 (選做)準(zhǔn)備SOD標(biāo)準(zhǔn)品:需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品,,用本試劑盒提供的SOD提取液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度:200,、100、50,、20,、10、5,、2U/ml,各取20μl參考樣品進(jìn)行檢測,。注意:為避免稀釋后SOD酶活性的下降,, SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用,該試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品,,但可使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考
4,、 SOD加樣:參考下表使用小離心管或試管設(shè)置空白對照管、光照對照管,、測定管,。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液,加入反應(yīng)啟動工作液后充分混勻,。注意:加入反應(yīng)啟動工作液后反應(yīng)即會開始,,可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動工作液的時間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
加入物(ml) | 空白對照管 | 光照對照管 | 測定管 |
SOD提取液 | 0.2 | 0.2 | — |
待測樣品(上清液) | — | — | 0.2 |
NBT酶工作液 | 1.6 | 1.6 | 1.6 |
反應(yīng)啟動液 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
5,、 SOD測定:混勻,,取空白對照管置于暗處,其他各管置于4000Lx日光下反應(yīng)20min,,各管受光情況應(yīng)一致,,溫度高時時間縮短,低時延長,;反應(yīng)結(jié)束后以不照光的空白對照管調(diào)零,,用分光光度計或酶標(biāo)儀測定560nm處吸光度,如果用分光光度計,,比色杯光徑1cm,,加入的上清量因根據(jù)比色杯的最小量程而定,。
五、計算結(jié)果:
SOD活力單位定義:以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U),。
液體中總SOD活力(U/ml)=(A光照-A測定)/(50%×A光照×VT)
組織,、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A光照-A測定)×V/(50%×A光照×VT×W)
血液中總SOD活力(U/gHb)=(A光照-A測定)×V×C/(50%×A光照×VT×Hb)
式中:A光照=光照對照管的吸光度
A測定=測定管的吸光度
V=樣品液總體積(ml)
VT=測定時樣品所用體積(ml)
W=樣品鮮質(zhì)量(g)
C=1ml/采血量(ml)
Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)
六、注意事項:
1,、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融,,以免失效或效率下降。
2,、 待測樣品-70℃可保存1個月,,需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。
3,、 細(xì)胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液,,否則會干擾本試劑盒的檢測。
4,、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾,,例如0.1mM ascorbic acid,5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高,。
5,、 對于植物樣品,研磨處理應(yīng)迅速,,以免SOD酶活下降,,盡量處于冰浴狀態(tài)處理。
6,、 如果無4000Lx日光,,可200W在10~12cm處垂直照射20min;在超凈工作臺5cm垂直照射30min左右,;在強(qiáng)太陽光下垂直照射30min左右,。
7、 一般要求各管受光情況一致,,所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈管平行的直線上,。
8、 反應(yīng)溫度控制在25℃,,視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時間,;溫度較高時,光照時間應(yīng)縮短,;溫度較低時,,光照時間相應(yīng)延長。
9,、 所用離心管或試管應(yīng)潔凈透明,,透光性好,。
10、 如果配制的NBT酶工作液出現(xiàn)淡黃色沉淀或絮狀物應(yīng)棄用,,否則效果不佳,。
11、 如果用酶標(biāo)儀,,96孔板每孔應(yīng)加20μl上清液,,相應(yīng)檢測的次數(shù)大大增加。
12,、 為了您的安全和健康,,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
七,、有效期∶6個月有效,。
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
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