適用機型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480

需要準備的耗材與設備：

實驗前請準備好下列耗材與設備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯(lián)排管
◆ 1000μL,，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴

◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規(guī)格移液器（如1000μL,，200μL,，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

實驗步驟：

一,、 樣品前處理

詳見樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書,。

二、 qPCR操作步驟

1. 定量參考品及NCS,、NTC的制備
1.1 定量參考品：取出 CHO DNA 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化,；待完-全融化后,，輕微振蕩混勻，瞬時離心,；

1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管,，分別標記為 ST0，ST1,，ST2,，ST3，ST4,，ST5,，ST6；

1.3 標準品稀釋過程如下表：

2. q-PCR 反應液的制備和加樣
2.1 根據(jù)所需檢測的標準樣品和待測樣品數(shù)量（一般做3個復孔）,，計算所需孔數(shù)：
      反應孔數(shù) =（6 個濃度梯度的標曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3
2.2 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
      qPCR Mix =（反應孔數(shù) +2 或 3）× 20μL（2 或 3 為操作損失量）
2.3 將所需試劑置于冰上融化,，輕微振蕩混勻，按表 2 所示配制制 qPCR Mix,。

qPCR Mix 配制表

3. 將所需試劑置于冰上融化,，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣（總體積30μL）：

各反應孔加樣示例

4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯(lián)管或者96孔板進行反應,，需去除反應體系中的氣泡,，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應程序和參數(shù)設置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例,。）

1.創(chuàng)建實驗反應程序,，設置兩步法反應程序如下表：

2.創(chuàng)建實驗反應板，點擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM,；在反應板圖表中,，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇Unknow,，勾選熒光 FAM,，Target Name 命名為 CHO-DNA；輸入每個樣品的重復次數(shù)及 Sample Name,。( 備注：如儀器要求設置猝滅基團與參比熒光：猝滅基團為 None,，參比熒光為 ROX。)

3.在反應板圖表中,，選擇標曲孔,，在 Sample Type 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM,，Target Name 命名為 CHODNA,；輸入每個稀釋梯度的重復次數(shù)及 Sample Name。分別在 ST1,、ST2,、ST3、ST4,、ST5,、ST6 的 Concentration 一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04,、3.00E+03,、3.00E+02、3.00E+01,、3.00E+00（單位為 fg/μL）,。

4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。

四,、 qPCR結果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation,，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）,、擴增效率（Effect）,、R²。
2. 在視窗Quantitation Data 中,，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC,、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL,。
3. 數(shù)據(jù)可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0,，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應大于標曲最-低濃度的 CT 值或根據(jù)實驗室自身驗證結果設定標準,；

• 標準曲線線性相關系數(shù)R²≥0.98,，擴增效率85%~110%之間；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3),。

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩(wěn)定性（凍融等因素）的驗證,，無需分裝。

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環(huán)境需區(qū)分區(qū)域,，不可在一個區(qū)域內操作,，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩,、手套和穿好潔凈服,。

3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染,，避免長時開蓋,。

4. 試劑盒必須在有效期內使用。

5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環(huán)境融化后使用,。

6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法,，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優(yōu)良檢測效果。

7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續(xù)qPCR檢測,，以保證檢測結果的準確性。

8. 最終的試驗結果與試劑的有效性,、操作者的操作方法及試驗環(huán)境密切相關,。

9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責,，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,，預留充足的樣本。

10. 本試劑盒僅供體外研究使用,，不用于臨床診斷,。

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