為什么培養(yǎng)的細胞要凍存？凍存的通用步驟是什么,？有什么注意事項,？以上三個問題就是本期我們要探討的內(nèi)容，
為什么要凍存,？
首先,，細胞培養(yǎng)過程中，考慮到細胞株傳代次數(shù)逐漸增加后,，細胞變異的可能性將增大,，繼續(xù)培養(yǎng)的話細胞株可能會出現(xiàn)老化、狀態(tài)下降,、丟失一些該細胞的特性的現(xiàn)象,，對后續(xù)實驗造成影響；
此外,，如果該細胞株特別珍貴,，屬于實驗室重要資源，對細胞進行大規(guī)模的保存,，能有效降低課題項目執(zhí)行的風險;
最后，就是常見的風險規(guī)避問題,，正所謂人有失手,、馬有失蹄，再熟練的實驗操作者,、再厲害的實驗設(shè)備也是有出問題的可能,，一旦出問題，意味著細胞資源的損失,。
基于以上幾點,，細胞凍存對于一個實驗室或個人來說，是非常必要的操作,。
細胞凍存的通用步驟
既然了解了凍存的必要性,，接下來我們講一下凍存細胞的通用步驟。這個步驟適用于絕大多數(shù)的細胞以及絕大多數(shù)的實驗室環(huán)境,，它并不需要特別的試劑耗材,。
當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期晚期，但未進入平臺期之前,，也就是生長密度達到90%以上未到100%之前,，此時貼壁生長的細胞依然處于單層細胞狀態(tài)。將該細胞消化,，并進行計數(shù),。
然后通過調(diào)整細胞懸液體積，將細胞密度調(diào)整為2X10^6～2X10^7/mL。與此同時,，使用細胞培養(yǎng)級別的DMSO與wan全培養(yǎng)基混合,，配制凍存液，凍存液成分的體積比應(yīng)該為DMSO占20%：wan全培養(yǎng)基80%,。
將配置好的凍存液與細胞懸液按照體積1:1的比例進行混合,，轉(zhuǎn)移到凍存管內(nèi)，做好標記,，完成密封,。
接下來，按照4度半小時,、-20度一小時,、-80度過夜的順序逐步將凍存管的溫度下降。
如果實驗室內(nèi)有程序降溫盒,，則可以直接將凍存管放入盒內(nèi),，實現(xiàn)溫度的穩(wěn)步下降。最后,，將凍存管從-80度轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi),，進行長期保存。
細胞凍存的注意事項
1 在凍存之前,，確保細胞狀態(tài)良好,。包括：細胞生長密度符合上述規(guī)定、細胞無污染,、細胞形態(tài)良好沒有變異,。
2 DMSO可以溶解部分濾膜，如果要進行過濾,，應(yīng)該選擇不會被DMSO降解的濾器,，并且操作時務(wù)必帶手套。
3 凍存管的管蓋并不是擰得越緊越好,，因為管蓋內(nèi)有O型橡膠圈,，擰得太緊會讓其變形，造成泄漏,。當然,，太松也會泄漏。
4 細胞凍存的密度應(yīng)該要比傳代時的密度要高得多,，假如傳代時的密度是1X10^?5/mL,，那么凍存時可以將密度提高到100倍。
等到了復蘇后,，再將密度稀釋為1/20也依然能保持較高的生長密度,，但與此同時,，殘留的DMSO對細胞的影響則會大大降低。
5 凍存應(yīng)遵循慢凍,，復蘇則相反,，應(yīng)快速升溫。慢凍的原因是為了避免降溫時,，細胞內(nèi)的水分還未來得及脫離細胞,，但卻形成冰晶，對細胞造成損傷,。
但也要注意,，慢凍不等于無限制的緩慢降溫，因為太慢,，也會促成水分形成冰晶,。理想的降溫速度應(yīng)該是1度/分鐘的下降速度。
D2650是一款由Sigma公司生產(chǎn)的二甲基亞砜（DMSO）化學試劑,，該產(chǎn)品具有多項顯著的優(yōu)勢,。
首先，D2650是一種高極性,、高沸點的非質(zhì)子溶劑,，具有出色的熱穩(wěn)定性，可以溶于水以及乙醇,、丙醇,、苯和氯仿等大多數(shù)有機物。這種廣泛的溶解性使其被譽為“萬能溶劑",，為各種化學反應(yīng)提供了便利。
其次,，D2650在生物領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛,。它可以用作細胞冷凍保護劑，能保護細胞免受冰晶導致的機械損傷,。在細胞培養(yǎng)中,，D2650被廣泛應(yīng)用于原代、繼代培養(yǎng)和重組的異倍體和雜交瘤細胞系,、胚胎干細胞以及造血干細胞的凍存,。同時，由于其優(yōu)秀的溶解性和穩(wěn)定性,，D2650還可以用于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等化學反應(yīng),。
再者，D2650的產(chǎn)品質(zhì)量得到了嚴格的保證,。它經(jīng)過了無菌過濾（0.2微米）及內(nèi)毒素水平檢測,，保證了產(chǎn)品的無菌性和內(nèi)毒素含量低,。同時，Sigma公司的質(zhì)量管理體系保證了D2650的高品質(zhì),，使得用戶在使用時可以放心,。
此外，D2650還以其即用型凍存液的形式,，為用戶提供了便利,。這種凍存液無需添加血清或蛋白質(zhì)，也不含動物成分,，使得它在各種細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用更加廣泛,。同時，D2650的生產(chǎn)過程符合cGMP標準,，采用了USP級/最高質(zhì)量的成分,，進一步保證了其品質(zhì)。
綜上所述,，D2650這款化學試劑以其出色的溶解性,、熱穩(wěn)定性、生物應(yīng)用廣泛性和高品質(zhì)等特點,，成為了科研和工業(yè)生產(chǎn)中的重要工具,。無論是用于化學反應(yīng)還是細胞培養(yǎng)，D2650都能提供優(yōu)秀的性能和可靠的品質(zhì),。
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以上就是有關(guān)細胞凍存的步驟與注意事項，柏萊源生物預(yù)祝您試驗成功,！
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