在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA,。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染,。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子,。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解,，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大,。
在實(shí)驗(yàn)中,，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶,。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,，如煮沸、高壓滅菌等,。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗,、唾液等，也可存在于灰塵中,。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染,。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品,、塑料制品,、電泳槽、研究人員的手及各種試劑,。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶,。接下來，一起來跟小源學(xué)習(xí)防止RNA酶污染方法及注意事項(xiàng)總結(jié),。
防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間,。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）,。
3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等,，可先用去污劑洗滌,，雙蒸水沖洗,，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min,，然后用0.1% DEPC水沖洗,，晾干。
4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC,，在37℃處理12hr以上,。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌,。
RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不che底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,，從而抑制酶的活性,。
2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活,。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),，幾乎能抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白,。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活,。
5. 其它：SDS,、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用,。
注意事項(xiàng)
1.做RT前必需測(cè)RNA濃度,，逆轉(zhuǎn)錄體系對(duì)RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug,。
2. RT按要求做,，一般不會(huì)出太大問題。
3. PCR,，按常規(guī),。但如需擴(kuò)長(zhǎng)片段，則對(duì)前兩步要求較高,，需要有完整的cDNA存在,，不是單改變Mg2 濃度、退火溫度能解決的,。
本文內(nèi)容：防止RNA酶污染方法及注意事項(xiàng)總結(jié),，祝您實(shí)驗(yàn)成功~
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