Lipo2000試劑的使用范圍較廣,，它不僅可以用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染,、siRNA表達(dá)載體、雙鏈核糖核酸dsRNA轉(zhuǎn)染, 以及RNA等核酸轉(zhuǎn)染,，還可以用于文庫(kù)篩選的高通量轉(zhuǎn)染,。對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lipo 2000幾乎涵蓋了HEK293、CHO細(xì)胞,、HeLa等190多種細(xì)胞系,。本期內(nèi)容一起來(lái)學(xué)習(xí)下Lipofectamine™ 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)流程吧,！
(一)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前的準(zhǔn)備:
因轉(zhuǎn)染效率依賴(lài)于細(xì)胞培養(yǎng)密度，而Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑具有細(xì)胞毒性,，使用時(shí)需確保高細(xì)胞密度進(jìn)行,，建議根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度提前種板并使用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)并達(dá)到80%-90%匯合,，有助于獲得最高轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平,，且能最小化高轉(zhuǎn)染活性導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)降低影響。（可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞對(duì)試劑毒性的耐受程度調(diào)整細(xì)胞密度,。）
(二)DNA準(zhǔn)備：
內(nèi)毒素是影響轉(zhuǎn)染效率高低的因素之一,，請(qǐng)務(wù)必使用無(wú)內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒，獲得高純度的DNA,，紫外可見(jiàn)光光度法測(cè)濃度并標(biāo)記計(jì)算用量,。（質(zhì)粒純度：A260/A280 比值 (1.7-1.9)，越近 1.8 越好）
(三)轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：
血清會(huì)影響復(fù)合物的形成從而影響轉(zhuǎn)染效率,，用無(wú)血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,。DNA和Lipo2000的比例，絕大多數(shù)細(xì)胞系通常推薦1:2-1:3,，建議比例見(jiàn)下表,。
表：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000與質(zhì)粒的用量參照表
對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品（以六孔板為例），按如下方步驟制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物:
1) Lipo2000稀釋液：取合適的EP管加入1500μl（250μl/孔） Opti-MEM,，加入60μl（10μl/孔）Lipo2000混勻,，室溫下靜置5分鐘。
2) DNA稀釋液：根據(jù)DNA的種類(lèi)不同,，分別于EP管中加入250μl/孔Opti-MEM,，再加入4μg/孔質(zhì)粒DNA輕輕混勻。
3) 將1)Lipo2000稀釋液以250μl/孔加入到2)各DNA稀釋液中,，輕柔混勻,，室溫靜置30min，形成DNA-Lipo2000復(fù)合物,。
(四)轉(zhuǎn)染操作：
細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1小時(shí)左右更換新無(wú)雙抗無(wú)血清培養(yǎng)基,。將制備好的DNA-Lipo2000復(fù)合物分別加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)板輕輕搖動(dòng)使復(fù)合物分布均勻,。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h,，并在4-6h后更換wan全培養(yǎng)基。
(五)觀察：
如果轉(zhuǎn)染的是帶有熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒,，可以在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,。
(六)注意事項(xiàng)：
1)Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑4℃保存，不可凍存,。
2) Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率,。
3)有些無(wú)血清培養(yǎng)基(比如DMEM,CD293,SFMII,V-SFM等)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑時(shí)轉(zhuǎn)染效率有可能會(huì)降低,。
4)Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑不能渦旋、離心,、暴力吹打,，緩慢晃動(dòng)混勻即可。
5)用量?jī)H供參考,，具體用量請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型,、鋪板密度等其他實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
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