【微載體】
微載體指直徑在60-250μm,，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成,，較傳統(tǒng)二維平面基質(zhì)可提供更大的細(xì)胞貼附面積,，另外，利用微載體可以實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)并借助生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞的規(guī)?；a(chǎn),，節(jié)省人力、物力和空間,。
據(jù)GIR (Global Info Research)調(diào)研,，按收入計(jì)，2021年全球微載體收入大約1062.9百萬(wàn)美元,，預(yù)計(jì)2028年達(dá)到1321.3百萬(wàn)美元,，2022至2028期間，年復(fù)合增長(zhǎng)率CAGR為 3.2%,。調(diào)研預(yù)測(cè)顯示微載體的未來(lái)需求大規(guī)模擴(kuò)增,，但面對(duì)市場(chǎng)上琳瑯滿目的載體，我們?nèi)绾芜M(jìn)行選擇呢,？
下面我們將從幾個(gè)方面進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，幫助大家對(duì)微載體細(xì)胞培養(yǎng)有更多了解,。
【載體結(jié)構(gòu)與材質(zhì)】
① 結(jié)構(gòu)：
通常分為固體微載體（實(shí)心微載體和多孔微載體）和液體微載體,。
圖1：固體微載體的分類(lèi)及優(yōu)、劣勢(shì)分析（點(diǎn)擊查看大圖）
② 材質(zhì)：
微載體的制造材料也是細(xì)胞培養(yǎng)中的?個(gè)關(guān)鍵因素,，因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)胞有物理和化學(xué)作?,，包括孔隙率、機(jī)械強(qiáng)度,、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透性,、尺?、密度和形狀【2】,。
? 人工合成的高分子材料：
例如聚苯乙烯微載體,、中空玻璃微載體、聚苯烯酞胺微載體等,；
? 天然來(lái)源的高分子材料：
例如交聯(lián)明膠微載體,、纖維素微載體,、殼聚糖微載體、海藻酸,、透明質(zhì)酸等,；
? 其他無(wú)機(jī)材料：
例如玻璃微載體等。
【貼壁依賴的動(dòng)物細(xì)胞在微載體上貼壁,、增殖和收獲】
① 微載體影響細(xì)胞貼附的因素【2】
（1）細(xì)胞與微載體的相融性
細(xì)胞與微載體的相容性主要與微載體基質(zhì)表面的化學(xué),、物理性質(zhì)相關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí),，表面帶負(fù)電荷,。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度,。若微載體帶負(fù)電荷,，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí),，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附,。
市場(chǎng)上常見(jiàn)的傳統(tǒng)微載體采用的基本基質(zhì)，如聚苯乙烯,、葡聚糖,、玻璃等聚合物為電中性的材質(zhì)，無(wú)法支持細(xì)胞貼壁,，因此通常修飾正電荷或化學(xué)鍵合,，以促進(jìn)具有不均勻表?負(fù)電荷分布的貼壁細(xì)胞的附著。?具有較?電荷密度的微載體被開(kāi)發(fā)?于促進(jìn)弱細(xì)胞系的細(xì)胞粘附（例如 Cytopore 1 和 2）,。
? 微載體表面的化學(xué)修飾：
△ 將化學(xué)基團(tuán)結(jié)合到載體表面是一種常見(jiàn)的方法（原理通過(guò)改變載體表面電荷的親水性或疏水性）如氨基,、伯胺、叔胺和三?胺等基團(tuán)等改變載體表面電性或羧基化,、羥基化提高微載體親水性,；
△ 引入含相關(guān)細(xì)胞貼附位點(diǎn)的蛋白，如：纖連蛋白,、膠原蛋白和層粘連蛋白等,。
（2）載體表面物理特征，包括形貌和粗糙度,，如多孔或者實(shí)心,。
（3）取決于細(xì)胞與微載體接觸的幾率
?載體、細(xì)胞的接種密度,；
? 攪拌條件：較低的攪拌速度利于細(xì)胞的接種,，而MSC更適合減速接種【2】
② 細(xì)胞在微載體表面的增殖的影響因素
影響細(xì)胞在微載體表面增殖或分化的因素很多，主要有三個(gè)方面。
（1）在細(xì)胞方面：如細(xì)胞群體,、活性,、狀態(tài)和類(lèi)型。
（2）在微載體方面：如微載體表面的生化性能,、吸附的大分子和離子,；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢,；表面物理特征如剛度和彈性模量,、形貌等均會(huì)影響細(xì)胞的增殖或分化。文獻(xiàn)報(bào)道剛性表面剛度在34Kpa時(shí)會(huì)導(dǎo)致MSCs呈紡錘狀并向骨分化,，表面為1Kpa的低剛度則促進(jìn)了軟骨,、脂肪、神經(jīng)元分化,，而中等表面剛度則促進(jìn)向肌肉分化【2】,。
（3）在培養(yǎng)環(huán)境中：如培養(yǎng)基組成、溫度,、pH,、氧以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件***,，則細(xì)胞生長(zhǎng)快,；反之生長(zhǎng)速度慢。
③ 貼壁依賴的動(dòng)物細(xì)胞在微載體上的收獲：
容易收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品是優(yōu)秀微載體的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),，同時(shí)也是用戶選擇載體的關(guān)鍵指標(biāo)之一,。
目前市面上常規(guī)的傳統(tǒng)微載體主要采用聚苯?烯、葡聚糖,、纖維素或玻璃等不可溫和降解的聚合物作為微載體的基本基質(zhì),。因此在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，較難將細(xì)胞與微載體充分分離成為這些微載體在細(xì)胞收獲過(guò)程中需要突破的挑戰(zhàn)【2】,。尤其市面上常規(guī)的微載體通過(guò)表面修飾增強(qiáng)了電荷,，依靠電荷提供較強(qiáng)的細(xì)胞貼壁效果，這使得在細(xì)胞分離時(shí)需要較強(qiáng)的酶消化強(qiáng)度和時(shí)間,，而且不能令細(xì)胞消化下來(lái)，如此導(dǎo)致較大的細(xì)胞損失和細(xì)胞損傷,。
另一方面,，不可降解的微載體與細(xì)胞均為固體物質(zhì)，僅靠常規(guī)離心無(wú)法分離,，需要額外的梯度離心或者過(guò)濾的方法將微載體去除以獲得細(xì)胞,，增加了整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的成本和過(guò)程的復(fù)雜性，降低了細(xì)胞回收率和活性。更進(jìn)一步的,，所收獲的細(xì)胞用于治療存在安全隱患,，因?yàn)槲⑤d體顆粒若無(wú)法得到有效去除，其殘留將導(dǎo)致后續(xù)細(xì)胞制品注射體內(nèi)將引起血管堵塞或者異物排斥等安全性問(wèn)題,。
【應(yīng)針對(duì)不同應(yīng)用選擇適合的微載體】
綜上不難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能否在微載體表面附著生長(zhǎng)并擴(kuò)展取決于細(xì)胞的特性,、微載體理化性質(zhì)、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,。而微載體性能的優(yōu)良與否是關(guān)鍵的因素,，它不僅影響培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、貼壁率,、生長(zhǎng)速率,、細(xì)胞密度以及是否容易收獲細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物，乃至于產(chǎn)物的整個(gè)生產(chǎn)成本,。
針對(duì)不同的細(xì)胞類(lèi)型不僅要篩選合適的微載體,，也需要合適的接種條件及培養(yǎng)條件，而對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)研發(fā)和生產(chǎn)的企業(yè)來(lái)說(shuō),，對(duì)各類(lèi)型微載體的認(rèn)識(shí)不是很***,，在選擇過(guò)程中有很多關(guān)鍵的因素根本考慮不到。
目前華龕生物能夠提供基于不同細(xì)胞在微載體上從接種,、培養(yǎng),，到體系放大和收獲等一整套解決方案。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療,、病毒疫苗,、基因工程和組織工程等領(lǐng)域。
【實(shí)例】
① 生物醫(yī)藥領(lǐng)域的微載體應(yīng)用現(xiàn)狀——細(xì)胞治療領(lǐng)域
間充質(zhì)?細(xì)胞的臨床應(yīng)?需要數(shù)?億個(gè)細(xì)胞和?維平臺(tái),，這可能對(duì)擴(kuò)?規(guī)模構(gòu)成挑戰(zhàn),。
為了在細(xì)胞移植和組織?程應(yīng)?中獲得可 擴(kuò)展的未分化間充質(zhì)?細(xì)胞數(shù)量，與?維培養(yǎng)相?,，三維培養(yǎng)技術(shù)是?種更***的?法【2】,。
例如：華龕生物利用原創(chuàng)3D TableTrix®W系列多孔可降解微載體、僅針對(duì)載體的裂解液結(jié)合自動(dòng)化生物反應(yīng)器和細(xì)胞收獲裝置可實(shí)現(xiàn)一次1010級(jí)別的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑產(chǎn)量,。
② 生物醫(yī)藥領(lǐng)域的微載體的應(yīng)用現(xiàn)狀——病毒疫苗領(lǐng)域(vero細(xì)胞)【3】
文中提出已經(jīng)工業(yè)化的微載體技術(shù)為使用 Vero 細(xì)胞系生產(chǎn)病毒提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái),，但實(shí)現(xiàn)更高的病毒生產(chǎn)力，該平臺(tái)面臨著一些挑戰(zhàn),。與生物工藝相比與其他動(dòng)物細(xì)胞系相比,，Vero 細(xì)胞密度仍然相對(duì)較低，一般不超過(guò) 107 個(gè)細(xì)胞/mL（圖3）,。
文中給出的解決方案：
（1）更深入的研究：分析高細(xì)胞濃度下 Vero 細(xì)胞的狀態(tài)（代謝組學(xué),、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組織學(xué)等方面充分的研究）,。
（2）更合適得培養(yǎng)策略：實(shí)時(shí)的營(yíng)分和待測(cè)物濃度檢測(cè)，并且及時(shí)的供給及排出【3】,。
實(shí)際上,，目前華龕已經(jīng)實(shí)現(xiàn)使用3D TableTrix®V系列可高溫滅菌微載體，配合3D FloTrix®vivaSPIN 自動(dòng)化生物反應(yīng)器,，在微載體4g/L~10g/L的條件下,，連續(xù)培養(yǎng)一周的時(shí)間即可獲得1×107cells/mL的較高細(xì)胞培養(yǎng)密度。Vero細(xì)胞在微載體上,，有較好的貼附能力,，該細(xì)胞密度滿足于疫苗的大量生產(chǎn)并且已有相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示其產(chǎn)毒效率亦顯著高于傳統(tǒng)微載體（圖4）。
圖4：使用不同類(lèi)型微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞產(chǎn)生的某病毒滴度對(duì)比
參考文獻(xiàn)
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