膜蛋白在細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸,、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖分化等許多生命活動(dòng)中起著非常重要的作用,，是重要的藥物靶點(diǎn),。然而，由于表達(dá)量低,、構(gòu)象不穩(wěn)定,、難分離純化等原因，許多研究受限于膜蛋白難表達(dá)而止步不前。
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)某課題組就遇到這樣一個(gè)難題：某膜蛋白用原核體系難以表達(dá),，經(jīng)過兩年時(shí)間反復(fù)嘗試,，仍未攻克難關(guān)。
珀羅汀生物基于自主研發(fā)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）系統(tǒng),，已成功表達(dá)多例全長跨膜蛋白,。該課題組慕名而來，在進(jìn)一步了解CFPS技術(shù)以及珀羅汀生物在無細(xì)胞領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢之后,，決定委托珀羅汀生物,，利用CFPS平臺嘗試表達(dá)該膜蛋白。
測試方法
收到客戶質(zhì)粒后,，珀羅汀生物研發(fā)人員立即著手構(gòu)建線性表達(dá)模板,，為了直接觀測目標(biāo)膜蛋白的表達(dá)情況并提高其可溶性，研發(fā)人員還構(gòu)建了融合GFP的表達(dá)模板,。隨后,，采用專研的針對膜蛋白的CFPS體系（即PLDK002試劑盒來源體系），并添加去垢劑【1】,，于收到質(zhì)粒當(dāng)天完成無細(xì)胞反應(yīng)體系構(gòu)建,。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
組別 | NC | A1 | A2 | B1 | B2 |
是否融合GFP | - | - | - | + | + |
是否添加去垢劑 | - | - | + | - | + |
純化標(biāo)簽 | - | His標(biāo)簽 | |||
注：【1】該去垢劑是依據(jù)珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)案例庫的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選出。
測試結(jié)果
圖1融合GFP的目標(biāo)膜蛋白在照膠儀下發(fā)出綠色熒光
次日,，取反應(yīng)后上清,，進(jìn)行親和純化、表達(dá)鑒定,。如圖1所示,，B1、B2兩組在照膠儀下均發(fā)出綠色熒光,，提示融合GFP的目標(biāo)膜蛋白無論是否添加去垢劑,，均可在CFPS體系的上清液中可溶表達(dá)！
圖2 目標(biāo)膜蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖
經(jīng)考染,、脫色后，如圖2所示,，未融合GFP的目標(biāo)膜蛋白（A1,、A2組）同樣在上清液中可溶表達(dá)！此外,，分別對比A1,、A2組與B1、B2組可以發(fā)現(xiàn),，添加去垢劑可促進(jìn)該膜蛋白的可溶表達(dá),。
總結(jié)
珀羅汀CFPS系統(tǒng)不負(fù)眾望，兩天之內(nèi)，成功表達(dá)了困擾該課題組長達(dá)兩年的膜蛋白,，“難表達(dá)蛋白的救星"名副其實(shí),！本次實(shí)驗(yàn)的成功，再次顯示出珀羅汀CFPS技術(shù)在膜蛋白等難度蛋白表達(dá)領(lǐng)域中的絕倫,。
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