膜蛋白幾乎在所有生理過程中都起著重要作用,，這些作用包括但不限于細胞間接觸、表面識別,、酶活性或跨膜運輸?shù)?。膜蛋白作為生物膜功能的主要承?dān)者，其對于維持細胞乃至生物體的正常生理功能至關(guān)重要,。據(jù)統(tǒng)計,，約50%藥物的靶向分子為膜蛋白，特別是跨膜蛋白,，它們占據(jù)了已知藥物靶點的很大比例,。膜蛋白研究不僅有助于揭示疾病的發(fā)生機制，還能推動生物學(xué)研究的深入,。此外,，研究人員還可以設(shè)計出具有特定功能的膜蛋白或基于膜蛋白的生物材料。這些新材料在生物醫(yī)學(xué),、環(huán)境保護,、能源開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。因此,，膜蛋白的研究至關(guān)重要,。
然而，目前膜蛋白研究依舊面臨著困境,。首先在生物體內(nèi)膜蛋白的表達量較低,，其次，因膜蛋白自身具有高度疏水性,，因此它在溶液中很容易形成聚集體,，另外膜蛋白可能包含多個跨膜區(qū)域，糖基化修飾等等,，且它在常規(guī)條件下難以維持正確的構(gòu)象,。
一
研究背景
傳統(tǒng)的基于細胞的膜蛋白表達通常會存在問題，比如：低產(chǎn),、細胞毒性,、蛋白質(zhì)聚集以及錯誤折疊等。而膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究也因為難以生產(chǎn)足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品而受到嚴重阻礙,。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,，無細胞蛋白質(zhì)表達（CFPS）系統(tǒng)正被視為克服上述障礙的可行替代工具，因為在CFPS系統(tǒng)中幾乎不需要考慮細胞活力和蛋白表達過程,，此外,，該系統(tǒng)的開放性允許研究人員直接控制反應(yīng)條件，例如,，添加輔助試劑,，各種形式的脂質(zhì)、催化劑等等,。
圖1:當(dāng)前膜蛋白的CFPS策略
二
去垢劑存在下的CFPS
相比于傳統(tǒng)的基于細胞的表達系統(tǒng)來說，CFPS系統(tǒng)由于其與細胞活性解耦的特性,，提供了一種更加快速高效的蛋白質(zhì)合成方案,。而去垢劑在此過程中起到了關(guān)鍵作用，通過溶解膜蛋白并防止其聚集,，從而去提高膜蛋白的可溶性和表達效率,。
已有研究討論了去垢劑對體外表達的膜蛋白的影響，那些在產(chǎn)量和溶解度方面都成功的實驗是使用臨界膠束濃度（CMC）相對較低的溫和去垢劑,，而為了防止聚集體或不均勻的蛋白質(zhì)聚合物的形成,，表達的蛋白質(zhì)和膠束之間的摩爾比不得高于1。通常是不建議使用具有相對高CMC的去垢劑,，因為它們必須以相當(dāng)高的濃度存在,，因此會抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯。
三
重組或直接插入囊泡和脂質(zhì)體
體外膜蛋白重建的理想情況是在更類似于天然脂質(zhì)雙分子層的環(huán)境中工作,。將膜蛋白重新構(gòu)建或直接插入到囊泡和脂質(zhì)體中,，是CFPS系統(tǒng)中一種重要的策略，這有助于研究膜蛋白的功能和結(jié)構(gòu),。其中重新構(gòu)建策略有兩種，包括從沉淀物中重新構(gòu)建以及利用吸附劑顆粒,。直接插入的策略也有兩種,，包括在無細胞表達反應(yīng)中直接加入脂質(zhì)體（如DOPC、DMPC等）以及利用倒轉(zhuǎn)囊泡的方法,。
通過重新構(gòu)建或直接插入囊泡和脂質(zhì)體的方法來實現(xiàn)更接近膜蛋白的天然環(huán)境,，這將有助于保持膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，適用于功能研究和藥物傳遞等。然而脂質(zhì)體和囊泡的異質(zhì)性可能會影響結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,，且高質(zhì)量的倒轉(zhuǎn)囊泡樣本難以制備,，商業(yè)上也不易獲得。
四
使用納米脂蛋白顆粒（NLPs）
為了克服使用微粒體和囊泡的局限性,，最近提出了基于使用“納米生物"或“納米脂蛋白顆粒"（NLP）的新策略,。它是一種納米級的盤狀顆粒，由兩親性螺旋蛋白（即支架蛋白）包裹在脂質(zhì)雙分子層的平面圓周上形成,。NLPs的直徑取決于所使用的支架蛋白類型,，通常在9～20納米之間，且分子質(zhì)量偏差非常?。?lt;5%）,，這使得它們具有高度的單分散性。這種結(jié)構(gòu)為膜蛋白的表達和研究提供了理想的平臺,。
NLPs通過其的結(jié)構(gòu),，能夠穩(wěn)定地包裹和呈現(xiàn)膜蛋白，有助于保持其天然構(gòu)象和功能,。與微粒體和囊泡等傳統(tǒng)載體相比,，NLPs具有更高的穩(wěn)定性和可控性，從而顯著提高了膜蛋白的表達效率和純度,。此外,，NLPs還具有高度的可定制性，可以通過選擇不同的支架蛋白（如載脂蛋白A1,、E和C,，以及昆蟲的脂磷蛋白等）來適應(yīng)不同類型的膜蛋白需求。
圖2:NLP存在下的無細胞蛋白質(zhì)表達
五
未來展望
1. 結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)與機遇
盡管CFPS技術(shù)在研究膜蛋白方面已經(jīng)取得了顯著進展,，部分膜蛋白結(jié)構(gòu)已通過X射線晶體學(xué)和固態(tài)核磁共振（NMR）技術(shù)得到解析，但在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域仍面臨重大挑戰(zhàn),。未來,，需要更多地探索CFPS技術(shù)與結(jié)晶技術(shù)（如脂質(zhì)立方相結(jié)晶）之間的協(xié)同效應(yīng)，比如使用NLP（納米脂質(zhì)顆粒）-蛋白質(zhì)復(fù)合物而非去垢劑溶解的蛋白質(zhì)來填充立方相基質(zhì),，以期提高結(jié)構(gòu)解析的成功率和質(zhì)量,。
2.多樣化表達策略
CFPS膜蛋白在產(chǎn)量、溶解度和蛋白質(zhì)質(zhì)量方面取得了顯著改進,。未來,，這一領(lǐng)域的研究將繼續(xù)聚焦于優(yōu)化反應(yīng)條件，以較大化膜蛋白的產(chǎn)量,，并改善其溶解性和功能活性,，從而推動下游應(yīng)用的發(fā)展,。無細胞表達膜蛋白的策略多種多樣，包括在去垢劑存在下的表達,、作為沉淀表達,、在脂質(zhì)體或囊泡存在下的表達、使用NLPs的表達,，以及與支架蛋白的共表達等等,。每種策略都有其優(yōu)勢和局限性。未來的研究將進一步開發(fā)和優(yōu)化這些策略,，以適應(yīng)不同類型的膜蛋白和研究需求,。
3.跨學(xué)科合作與技術(shù)創(chuàng)新
膜蛋白研究的復(fù)雜性要求跨學(xué)科的合作，包括生物化學(xué),、分子生物學(xué),、物理學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。未來的研究將借助高通量篩選,、機器學(xué)習(xí)等新技術(shù),，加速新方法的開發(fā)和應(yīng)用，以提高無細胞表達膜蛋白的效率和成功率,。
隨著無細胞表達膜蛋白技術(shù)的不斷成熟,，其應(yīng)用前景也將更加廣闊。在藥物研發(fā),、生物傳感器,、生物能源、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域,，膜蛋白都展現(xiàn)出巨大的潛力,。未來，將更多地探索這些潛在應(yīng)用,，推動相關(guān)技術(shù)的轉(zhuǎn)化和商業(yè)化,。
參考文獻：
Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006
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