哈嘍寶子們,，我最近遇到了一個難纏的蛋白，用大腸桿菌表達后會出現(xiàn)在沉淀中,。如果從沉淀中提取純化,，操作復雜姑且不論，還有可能沒有活性,！如果優(yōu)化培養(yǎng)條件讓它在上清中表達,，需要慢慢摸索，費時費力還不一定成功,。這幾天為了思考解決辦法,，真是要茶飯不思了！
閉門造車不如出門取經(jīng),，這不,，我在萬能的師兄這里求來了一樣新“法寶"，據(jù)說它可以讓包涵體蛋白在上清中表達,。今天讓我們一起來看一下它究竟“威能"如何吧,！內(nèi)含我的真實實驗步驟+結(jié)果+操作Tips哦,。
如何拯救包涵體蛋白？
“法寶"顯威——無細胞蛋白表達試劑盒初體驗
一,、使用前準備
打開試劑盒,，讓我們看一下它的廬山真面目。
試劑盒內(nèi)一共三個組分,，分別是：
組分A,、組分B、PC（陽性對照質(zhì)粒）,。
將各組分取出，在冰上融化,。
二,、模板準備
與原核細胞表達不同，這款無細胞試劑盒可以不用質(zhì)粒模板,，只需要在目的基因上下游引入T7轉(zhuǎn)錄表達原件,，構(gòu)建一個線性模板。
第一步,，用PCR分別獲得5UTR片段,，3UTR片段以及目的基因片段；
第二步,，用重疊PCR方法,，將上一步獲得的目的基因片段和5UTR片段，3UTR片段拼接稱完整的線性表達模板,。
三,、體系構(gòu)建
由于是初次嘗試，我這次選擇50μL的總體積,。在96孔板中反應,，按照這張表加試劑和構(gòu)建好的DNA模板5μL（體系體積的1/10），用移液槍反復吹打混勻,。
試劑 | 陰性對照（μL） | 陽性對照（μL） | 實驗組（μL） |
組分A | 20.5 | 20.5 | 20.5 |
組分B | 16.7 | 16.7 | 16.7 |
DNA模板 | / | 5 | 5 |
雙蒸水 | 12.8 | 7.8 | 7.8 |
反應總體積 | 50 | 50 | 50 |
四,、孵育
將混合好的反應液轉(zhuǎn)移至搖床中，溫度25℃,、180rpm,，反應16h，確保蛋白表達,。
孵育四小時后,，迫不及待先看一下GFP的表達情況，觀察到陽性對照已有明顯綠色熒光,。
五,、收獲
次日一早,，打開搖床就看到了陽性對照醒目的綠色熒光。既然陽性對照表達了,，目標蛋白想來不成問題,！滿懷期待開始離心、跑膠鑒定,。
六,、鑒定
將陰性對照和實驗組分別制洗脫樣、上清樣,、沉淀樣,，上樣量：洗脫樣、上清樣10μL,，沉淀樣5μL,。電泳條件：12%SDS-PAGE膠，100V,，1.5h,。
不愧是師兄力薦的“法寶"，沒有辜負我的厚望,，第一次實驗,，我的蛋白就在上清中成功表達了！
七,、總結(jié)
這次實驗真是一次全新的體驗,。在無細胞蛋白表達體系下，整個實驗從模板構(gòu)建,、反應體系構(gòu)建,、孵育、到最后收獲目標蛋白并鑒定,，只用了兩天時間,，不但在上清中表達出了原核細胞表達中會形成包涵體的蛋白，還大大縮短了實驗時間,。真讓我有把所有蛋白都用無細胞體系表達的沖動,！
1.無細胞蛋白表達試劑盒可以用線性模板也可以用質(zhì)粒模板，線性模板更加方便快捷,，但是質(zhì)粒模板表達量一般較高,。
2.組分A、B在實驗前要提前放在冰上融化,，防止試劑失效,。使用前先用移液槍吹打混勻，再吸取相應體積。
3.微孔板四周可以加入適量雙蒸水,，防止孵育過程中體系水分蒸發(fā),。本次實驗因為要過夜表達，為了確保反應體系不被蒸干,，我在96孔板最外側(cè)一周的所有孔位里都加了水,，而且在搖床四角也各放置了一只裝水的離心管。
4.對于復雜蛋白表達,，可以延長孵育時間,，保證蛋白充分表達。
5.如果調(diào)整反應體積,，需要按照說明書推薦隨之調(diào)整反應容器,。
CFPS——蛋白表達“新勢力"
初次表達包涵體大獲成功，無細胞蛋白表達究竟是“何方神圣",？在實驗結(jié)束之后,，我粗略了解了一下這一新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)它的強大不止于此,。
無細胞蛋白表達（Cell-free protein expression，CFPS）是指將細胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶,、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機器提取出來,，并輔以核苷酸、氨基酸,、能量物質(zhì)及基因模板,，在沒有活細胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物合成反應。
受細胞自身生理功能限制,，有些蛋白在傳統(tǒng)的細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)量低甚至不能表達,，而無細胞系統(tǒng)可以擺脫這種限制，廣泛適用于細胞因子,、抗體,、膜蛋白、毒性蛋白,、包涵體蛋白表達等場景,。此外，無細胞蛋白表達反應周期短,、易與自動化設備結(jié)合,、自由度與可控程度高，適合蛋白快速交付,、酶定向進化篩選,、AI蛋白制造、ADC藥物開發(fā)等領(lǐng)域,，可謂是蛋白表達領(lǐng)域的“新勢力",。
隨著合成生物學發(fā)展,，無細胞蛋白表達技術(shù)已然嶄露頭角，大有騰飛之勢,。技術(shù)的發(fā)展是推動科學研究進步的重要助力,，善于利用新技術(shù)，有時能使科研過程事半功倍,，我也算是深有體會了,！
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