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PCR引物的設(shè)計(jì)
五,、PCR引物的設(shè)計(jì)
（一）一般原則
1,、引物長度在15～30堿基。引物過短,，會使特異性降低,。過長會提高相應(yīng)的退火溫度，且合成引物的成本增加,。
2,、引物中堿基的分布是隨機(jī)的，避免4個以上的嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列,，G+C含量宜在
45～55％左右,。
3、避免兩引物間的互補(bǔ),，特別是3‘端互補(bǔ),，以免形成二聚體。
4,、引物自身不應(yīng)存在連續(xù)超過3bp的互補(bǔ)序列,， 否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身變性。
5,、引物的3’端不能有任何修飾,，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。
6,、引物的5’端限定著PCR產(chǎn)物的長度,，可根據(jù)產(chǎn)物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法,。
7,、引物與非擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過70％。
（二）引物設(shè)計(jì)的方法
1,、直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁,。
2,、引物設(shè)計(jì)軟件。功能：首先是引物分析評價功能,，其中以“Oligo 6"為優(yōu)秀,；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同,。
六,、PCR產(chǎn)物的檢測
（一）瓊脂糖凝膠電泳
是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定常用的方法,。其分辨率很高,，可測出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的膠,，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的膠,。
（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳
靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高，主要用于分離制備小于1kb長度的低分子質(zhì)量基因片段,，因此特別適用于合成的基因片段的分離和檢測,。適用于PCR擴(kuò)增效率低時產(chǎn)物的檢測,。根據(jù)擴(kuò)增片段的大小選擇合適的膠濃度,，電泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比EB染色檢測靈敏度高2～10倍,。
（三）層析技術(shù)
高效液相色譜(HPLC)是在常壓基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)現(xiàn)代化分析技術(shù),，其特點(diǎn)是分離速度快、效果好,，是目前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一,。
離子交換層析（ IEC ）的基礎(chǔ)是溶質(zhì)分子所攜帶的電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質(zhì),。因此,，IEC分析廣泛應(yīng)用于DNA的合成及其擴(kuò)增后的分離純化。
（四）分子雜交
為了確定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計(jì)的目的片段,，或產(chǎn)物是否有突變,，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交,。點(diǎn)雜交靈敏度較高,，特別適用于特異性不高的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。
Southern印跡雜交可鑒定PCR產(chǎn)物的大小和特異性,，檢測靈敏度可達(dá)10ng,。基本過程是PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳,，然后,，印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交檢測。
（五）限制性內(nèi)切酶酶切分析
若知道PCR擴(kuò)增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切圖譜,，則可選擇合適的限制酶消化PCR產(chǎn)物,，再進(jìn)行電泳分析，根據(jù)PCR酶切產(chǎn)物的電泳圖譜,，可判定PCR產(chǎn)物的特異性及是否存在突變,。
（六）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序
直接序列分析是指在PCR擴(kuò)增基因組DNA序列的基礎(chǔ)上，直接進(jìn)行基因核苷酸序列分析的方法,，是檢測基因突變有效,、直接的方法。
七,、PCR中應(yīng)注意的事項(xiàng)
（一）防止污染
試劑小量分裝
吸頭及Ep管一次性使用
器皿及工作區(qū)域要分開,，無菌操作
（二）設(shè)立對照：
陽性對照：陽性模板
陰性對照：陰性模板
試劑對照：除模板外的所有組分