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一,、PCR技術(shù)的簡史

1971年

Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交,，用DNA聚合酶延伸引物,，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因,。

但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能,，所以,，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……

1985年

美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制,，采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR,，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí),，費(fèi)力,，且易出錯(cuò)，耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行,，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀,。

1993年

Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

二,、PCR的基本原理

類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度,，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火,，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán),，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù),。

                                       PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；

      PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；

  PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈,。

End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence

每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。