利用步琦SFC系統(tǒng)純化
阿司匹林,、苯佐卡因和普魯卡因
SFC應(yīng)用
”
1
簡(jiǎn)介
化學(xué)合成常伴有雜質(zhì)，因產(chǎn)率很少達(dá) 100%,，雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響藥物療效,、安全和質(zhì)量，所以純化藥物保障其純度和完整性至關(guān)重要,，在現(xiàn)代藥物研發(fā)的過(guò)程中往往通過(guò)色譜法等多種方法純化,。
在上一篇應(yīng)用文章《利用步琦 SFC 系統(tǒng)純化利多卡因與乙酰氨基酚》中，我們使用超臨界流體色譜（SFC）高效純化了利多卡因和乙酰氨基酚的合成產(chǎn)物,。在此過(guò)程中,，我們先使用步琦 Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)快速篩選了色譜柱，之后將其放大到 BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)上,。本次應(yīng)用中,，我們依舊會(huì)使用同樣的工作流程去純化阿司匹林、苯佐卡因和普魯卡因的合成產(chǎn)物,。
2
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠,，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基,，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP,，5um,250×4.6mm
HILIC柱,，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure PEI,，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD,，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ,，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure 2-EP,，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×10mm
3
化學(xué)品與樣品
化學(xué)品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中 2M 的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水
為了安全處理,，請(qǐng)注意所有相應(yīng)的MSDS,！
樣品：
普魯卡因合成產(chǎn)物
阿司匹林合成產(chǎn)物
苯佐卡因合成產(chǎn)物
4
程序設(shè)定
BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜柱系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測(cè)：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動(dòng)相條件：
0 – 0.5 min | 5 % B | |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B | |
8.0 – 9.4 min | 50 % B | |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B | |
9.5 – 10 min | 5 % B | |
篩選運(yùn)行全自動(dòng)運(yùn)行,，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道,，使用流控單元，平衡每一根色譜柱,。樣品自動(dòng)注入（V=5μL）,，并開(kāi)始平行篩選（運(yùn)行時(shí)間=10min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar,，柱子加熱至 32℃,，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳,；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動(dòng)相條件：等度運(yùn)行條件
檢測(cè)：紫外
所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動(dòng)進(jìn)樣器上樣,，并開(kāi)始運(yùn)行,。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃,，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型,。
5
結(jié)果
5.1 阿司匹林
阿司匹林，化學(xué)名為乙酰水楊酸（下稱(chēng) ASA）,，是一種鎮(zhèn)痛和抗炎藥物,。它屬于非甾體抗炎藥（NSAIDs）這一類(lèi)?？梢酝ㄟ^(guò)將水楊酸（下稱(chēng) SA）與乙酸酐發(fā)生酯化反應(yīng)而化學(xué)合成（見(jiàn)圖5） [1] ,。為了確定乙酰水楊酸的理想分離選擇性，首先進(jìn)行了色譜柱柱篩選（見(jiàn)圖1）,。
▲ 圖 1：頂部：阿司匹林合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果,；從左到右：硅膠,，氨基，二醇基，氰基,，2-EP,，HILIC，PEI和CBD,；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘,。
由于 SA 在固定相中的保留性較高，為了強(qiáng)制洗脫 SA,，在梯度中增加了一個(gè)等度步驟,，即在 50% 改性劑濃度下進(jìn)行 5 分鐘的等度洗脫。在 HILIC 相中,，ASA 和 SA 只有噪音而無(wú)洗脫,。在 PEI 相中，在實(shí)驗(yàn)條件下只有 ASA 被洗脫,。除氰基相外,，其余各相均顯示出 ASA 和 SA 的分離。結(jié)合分離時(shí)長(zhǎng)和分辨率而言,，2-EP 相的結(jié)果最好（見(jiàn)表 1）
▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
選擇 2-EP 相作為固定相，放大至制備規(guī)模,。在色譜柱篩選的過(guò)程中,，ASA 和 SA 在 2-EP上被洗脫的甲醇比例為 26 - 40%。圖 2（上）顯示了在甲醇比例為 40% 的10x250mm 2-EP 色譜柱上純化 ASA 和 SA 的情況,。改性劑中添加了甲酸（0.5%）,，以改善 SA 的峰形。在不添加甲酸的情況下,，SA 的拖尾非常嚴(yán)重,。在相同條件下，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 ASA（見(jiàn)圖2下）,，并進(jìn)行餾分收集,。
▲ 圖 2：ASA 純化的單次進(jìn)樣（上圖）和疊加進(jìn)樣（下圖）,；運(yùn)行條件：流速 = 30 mL/min，改性劑 = 甲醇 + 0.5 % 甲酸,，改性劑 % = 40 %,，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar,，進(jìn)樣量 = 200 μL,，紫外波長(zhǎng) = 254 nm,；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 10，疊加時(shí)間 = 2.0 min,，餾分 = 1（基于時(shí)間）,。
5.2 苯佐卡因
苯佐卡因（下稱(chēng) BC），化學(xué)名為對(duì)氨基苯甲酸乙酯,，屬于局部麻醉劑類(lèi),。它可以從對(duì)氨基苯甲酸（下稱(chēng) PABA）通過(guò)酸催化羧基與乙醇的酯化反應(yīng)化學(xué)合成，用硫酸作為催化劑 [2],。首先進(jìn)行色譜柱篩選,，以確定苯佐卡因合成產(chǎn)物理想的分離選擇性（見(jiàn) 圖3）。
▲ 圖3：頂部：苯佐卡因合成反應(yīng)方程式,，底部：Sepmatix 8x SFC儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠,，氨基,，二醇基，氰基,，2-EP,，HILIC，PEI和CBD,；運(yùn)行時(shí)間 = 15分鐘,。
由于 PABA 在固定相中的保留性較強(qiáng)，因此在梯度中增加了一個(gè)等度步驟,，在 50% 甲醇的條件下運(yùn)行 5 分鐘,，硫酸通過(guò)洗滌步驟去除避免過(guò)高的酸性。各固定相的色譜圖顯示,，每種固定相都能分離苯佐卡因，但是洗脫速度和分辨率存在很大差異（見(jiàn)表2）,。HILIC 和氨基相的分辨率最高,，但 PABA 的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即使用50%的甲醇洗脫,，依舊需要很長(zhǎng)時(shí)間,。
▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序,。
結(jié)合柱篩選結(jié)果,，最終選擇二醇基相作為制備色譜柱。HILIC 和氨基相需要較高比例的甲醇和較長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間,。二醇基相不僅可以非?？焖俚叵疵摌悠?，并具有足夠高的分辨率。二醇基柱的篩選結(jié)果表明,，BC 和 PABA 在甲醇比例為 30 - 40% 時(shí)即可洗脫,。
圖 4（上圖）顯示了 10 x 250mm 的二醇基色譜柱在甲醇比例為 28% 時(shí)對(duì)苯佐卡因的純化情況。在相同條件下,，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 BC（見(jiàn)圖4下）,，并進(jìn)行餾分收集。
▲ 圖 4：苯佐卡因的單次注射（頂部）和堆疊注射（底部）純化,；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min， 改性劑 = 甲醇,，改性劑 % = 28%,，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar,，注射量 = 90 μL,，UV 波長(zhǎng) =276nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) =12,，堆疊時(shí)間 =0.66min,，餾分 =1（基于時(shí)間的）。
5.3 普魯卡因
普魯卡因（下稱(chēng) PC）,，化學(xué)名為 4-氨基苯甲酸 2-(N, N-二乙基氨基)乙酯,，是一種藥物，具有局部麻醉作用,。它阻斷電壓依賴(lài)性鈉離子通道,，從而導(dǎo)致例如疼痛敏感性的降低。普魯卡因可以通過(guò)化學(xué)方法在堿性條件下從 4-氨基苯甲酸乙酯（下稱(chēng)ABE）合成,。這涉及到使用 2-二乙基氨基乙醇進(jìn)行酯交換[3],。堿是乙醇鈉醇，它可以通過(guò)鈉與乙醇的反應(yīng)產(chǎn)生,。為確定普魯卡因合成產(chǎn)物純化的理想選擇性,，進(jìn)行了色譜柱篩選（見(jiàn)圖 5）。
▲ 圖5：頂部：普魯卡因合成的反應(yīng)方程式,，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠,，氨基,，二醇基，氰基,，2-EP,，HILIC,，PEI 和 CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 15分鐘,。
由于普魯卡因在固定相中的保留性較高,，因此在梯度中增加了一個(gè)等度步驟，即在 50% 甲醇濃度下進(jìn)行 5 分鐘的梯度,。結(jié)果顯示,，每種固定相對(duì)普魯卡因的純化都有合適的選擇性（見(jiàn)表3）。普魯卡因在硅膠,、PEI 和氰基固定相中的保留性較高,。
由于普魯卡因的基本特性，在部分色譜柱上的峰形非常不對(duì)稱(chēng),。二醇基相下的峰前沿非常明顯,，不對(duì)稱(chēng)度系數(shù)為 0.58，而硅膠相下的拖尾非常明顯,，不對(duì)稱(chēng)度系數(shù)為 2.73,。
▲ 表3：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序,。
結(jié)合柱篩選結(jié)果,，選擇 2-EP 相放大為制備純化的方法。硅膠相需要高含量的甲醇才能洗脫出 PC,，導(dǎo)致運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng),，峰形不佳。而 2-EP 相既可以快速洗脫樣品,，又具有足夠高的分辨率,。為了改善峰型，在甲醇改性劑中加入 5 % 的去離子水和 20 mM 的氨水作為添加劑,。
篩選結(jié)果表明,，PC 和 ABE 在改性劑含量約為 24 - 32% 時(shí)可以從色譜柱內(nèi)洗脫下來(lái)。圖6（上圖）顯示了10 x 250mm 的 2-EP 色譜柱在改性劑含量為 25% 時(shí)純化 PC 的情況,。在相同條件下,，可采用疊加進(jìn)樣法自動(dòng)純化 PC（見(jiàn)圖6，下圖）并收集餾分,，添加添加劑可顯著改善 PC 的峰形。
▲ 圖 6：普魯卡因純化的單次進(jìn)樣（上圖）和疊加進(jìn)樣（下圖）；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min,，改性劑 = 甲醇/水（95/5 %）加 20 mM 氨水,，改性劑 % = 25 %,，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar,，進(jìn)樣量 = 100 μL,，紫外波長(zhǎng) = 220 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 10,，疊加時(shí)間 = 1.1min,，餾分 = 2（基于時(shí)間）。
6
結(jié)論
超臨界制備色譜純化合成產(chǎn)物高效快速,，但需篩選合適的色譜填料,。BUCHI Sepmatix 8x SFC 平行色譜系統(tǒng)可快速篩選填料并放大至制備規(guī)格，既能提高樣品分離度,，又能充分利用色譜柱上樣量,，為 BUCHI Sepiatec SFC-50 制備系統(tǒng)的疊加進(jìn)樣奠定良好基礎(chǔ)，二者結(jié)合可達(dá)到降本增效的目的,。
7
參考文獻(xiàn)
Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-präparativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
4
立即詢(xún)價(jià)
您提交后,，專(zhuān)屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)