步琦SFC系統(tǒng)
純化利多卡因與乙酰氨基酚
SFC應(yīng)用
”
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簡介
藥物是一種由化學(xué)或生物來源制成的產(chǎn)品,，用于人類或動(dòng)物的醫(yī)療治療，這些藥物往往以化學(xué)合成的形式來生產(chǎn),?；瘜W(xué)合成是一種通常伴隨著雜質(zhì)存在的過程,，因?yàn)楫a(chǎn)率很少是 100%。這些雜質(zhì)可能會(huì)對最終產(chǎn)品的療效,、安全性和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響,。因此，對藥物進(jìn)行純化以確保合成化合物的純度和完整性是至關(guān)重要的,，藥物的純化可以通過色譜法等多種方法進(jìn)行,。
最近，超臨界流體色譜（SFC）已經(jīng)作為一種替代反相液相色譜（RP-HPLC）的方法出現(xiàn),。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動(dòng)相的一部分,，這是一種清潔且環(huán)保的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除,。此外,，SFC 結(jié)合了氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，在提供高分辨率的同時(shí)也能以更快的速度分離樣品,。
在 SFC 的方法開發(fā)過程中,，最大的難點(diǎn)在于沒有一種通用的固定相。因此需要在不同的固定相上進(jìn)行篩選,，以確定要分離的樣品的最好選擇性,。CO2 的低極性溶劑特性允許在色譜柱篩選時(shí)同時(shí)考慮非極性和強(qiáng)極性的固定相。在確定最佳固定相后,，就可以進(jìn)一步放大到制備規(guī)格,。
在本次應(yīng)用中，我們會(huì)例舉利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例,，利用 SFC 系統(tǒng)來高效去除合成過程中的雜質(zhì),，獲取高純度目標(biāo)化合物。在這一過程中,，需要先進(jìn)行合適色譜柱的篩選,，再放大至制備色譜的規(guī)格。
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設(shè)備
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠,，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基,，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP,，5um,250×4.6mm
HILIC柱,，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD,，5um,250×4.6mm
氰基柱,，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 氨基,，5um,250×10mm
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化學(xué)品與樣品
化學(xué)品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中2M的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水
為了安全處理,，請注意所有相應(yīng)的MSDS！
樣品：
乙酰氨基酚合成產(chǎn)物
利多卡因合成產(chǎn)物
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程序設(shè)定
BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳,；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動(dòng)相條件：
0−0.5min | 5%B |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B |
8.0 – 9.4 min | 50 % B |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B |
9.5 – 10 min | 5 % B |
篩選過程自動(dòng)運(yùn)行,，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道，使用流控單元,，平衡每一根色譜柱,。樣品自動(dòng)注入（V = 5 μL），并開始平行篩選（運(yùn)行時(shí)間 =10min）,。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar,，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型,。
BUCHI Sepiatec SFC-50超臨界制備色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳,；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動(dòng)相條件：等度運(yùn)行條件
檢測：紫外
所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動(dòng)進(jìn)樣器上樣,，并開始運(yùn)行,。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃,，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型,。
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結(jié)果
5.1 乙酰氨基酚
乙酰氨基酚（下稱 AA），也常被稱為對乙酰氨基酚,，是一種鎮(zhèn)痛劑,、解熱劑和手性藥物。它屬于非阿片類鎮(zhèn)痛劑這一類,。在化學(xué)上,，它可以通過對氨基苯酚（下稱 AP）與乙酸酐的反應(yīng)來合成，在此過程中發(fā)生 N-乙?；ㄒ?strong style="box-sizing: border-box;">圖1）,。為了確定乙酰氨基酚合成產(chǎn)物的最佳純化分離固定相，首先進(jìn)行了柱篩選（見圖1）,。
▲ 圖 1：頂部：乙酰氨基酚合成的反應(yīng)方程式,，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠,，氨基,，二醇基，氰基,，2-EP,，HILIC，PEI和CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘,。
圖1顯示,，二醇基和 2-EP 相并未表現(xiàn)出分離度，硅膠相,、CBD 相、氰基相和氨基相未顯示出理想的分離度,，因?yàn)樗鼈儫o法實(shí)現(xiàn)基線分離,。HILIC 和 PEI 相具有良好的選擇性和分辨率，且分辨率始終遠(yuǎn)高于 1.5（見表1）,。1.5 的分辨率意味著可以很好地分離 2 個(gè)峰,。表1 還顯示了洗脫順序，氰基相顯示出相反的洗脫趨勢,，對氨基苯酚先洗脫,，然后是對乙酰氨基酚。篩選結(jié)果表明,，反應(yīng)并非100,，因?yàn)楫a(chǎn)物中仍含有大量對氨基苯酚。
▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
選擇 PEI 相色譜柱放大至制備規(guī)格,，因?yàn)樗哂凶罡叩姆直媛剩ㄒ?span style="text-decoration-line: underline; box-sizing: border-box;">圖2）,。根據(jù)篩選時(shí)的色譜圖，我們可以確定 AA 和 AP 在甲醇為 35−40% 之間洗脫,。圖2（頂部）顯示了在 40% 甲醇等度條件下,，在 10 x 250mm 的PEI 色譜柱上對 AA 進(jìn)行純化的情況，結(jié)果顯示 AA 和 AP 可以非常良好地分離,。因此在相同的條件下,，可以實(shí)施一個(gè)堆疊注射方法，用于自動(dòng)純化并收集 AA （見圖2,，底部）,。
▲ 圖2：單次注射（頂部）和堆疊注射（底部）用于AA的純化；運(yùn)行條件：流速=30 mL/min,， 甲醇= 40 %,，溫度 = 40 ℃，壓力BPR = 150 bar,，注射 = 250 µL,，UV波長 = 254 nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) = 10,，堆疊時(shí)間 = 1.8 min,，F(xiàn)ractions = 1（基于時(shí)間的）。
5.2 利多卡因
利多卡因（下稱 L），化學(xué)名為 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺,，是一種用作局部麻醉劑和抗心律失常藥物的藥物,，它作為鈉通道阻斷劑起作用。利多卡因可以通過兩步合成過程生產(chǎn)（見圖3）,。第一步中,，2,6-二甲基苯胺（下稱 X）的氨基組團(tuán)被酰化 ,。第二步中,，中間產(chǎn)物（下稱 IP）通過與二甲胺的親核取代反應(yīng)轉(zhuǎn)化為利多卡因。因此,，需要進(jìn)行兩步純化過程,。色譜柱篩選的結(jié)果如圖3所示，篩選過程中,，在改性劑甲醇中始終添加 20 毫摩爾氨水作為堿性添加劑,。
▲ 圖 3：頂部：利多卡因合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選IP與利多卡因結(jié)果,；從左到右：硅膠,，氨基，二醇基,，氰基,，2-EP，HILIC,，PEI 和 CBD,；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
從結(jié)果來看,，所有色譜柱都可用于中間體 IP 的第一步純化分離,，因?yàn)槎季哂谢€分離的效果。其中氨基相具有最高的分辨率,，且在甲醇比例較低時(shí)就能出峰（見圖3）,。對于第二步利多卡因的純化，氰基和CBD相無法實(shí)現(xiàn)基線分離,，而氨基再次表現(xiàn)出最佳的分離度（見表2）,。在洗脫順序上，第一步中間體的純化出峰順序都是先 X 再 IP,，而第二步的利多卡因的純化除了硅膠相之外都是先 L 再 IP（見表2）,。
▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
最終選擇 10 x 250mm 的氨基色譜柱進(jìn)行制備純化，因?yàn)樗姆直媛士偸亲罡叩模ㄒ?strong style="box-sizing: border-box;">表2）,。氨基柱篩選結(jié)果顯示,，X 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 10 - 19%,，L 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 11 - 19%。圖 4 a) 顯示的是甲醇比例為 16% 等度條件下的 IP 的單次純化分離圖譜,，圖 4 b) 顯示的是甲醇比例為 20% 等度條件下的 L 的單次純化分離圖譜,。在相同的條件下，可以進(jìn)行疊層進(jìn)樣分離,，分別自動(dòng)純化 IP 和 L,，并進(jìn)行餾分收集（見圖 4 c) 和 d)）。
▲ 圖4：中間體 IP 的單次進(jìn)樣（a）和疊加進(jìn)樣（c）,；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min,，改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水，改性劑 % = 16 %,，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar,，進(jìn)樣量 = 170 μL,，紫外波長 = 254 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 15,，疊加時(shí)間 = 0. 75 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間); 利多卡因L的單次進(jìn)樣 (b) 和疊加進(jìn)樣 (d) ; 運(yùn)行條件：流速 =20 mL/min, 改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水, 改性劑 % = 20 %, 溫度 = 40 °C 和壓力 BPR = 150 bar, 進(jìn)樣 = 170 μL, 紫外波長 = 254 nm; 疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 20, 疊加時(shí)間 = 0.65 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間),。
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結(jié)論
在進(jìn)行有機(jī)合成后，由于副反應(yīng)或轉(zhuǎn)化率未達(dá)到 100%,，通常仍會(huì)存在雜質(zhì),，這些雜質(zhì)必須去除，尤其是在藥品生產(chǎn)中,。
在藥物合成研發(fā)領(lǐng)域,，時(shí)間與效率至關(guān)重要。BUCHI 的 SFC 色譜解決方案為研發(fā)人員提供了強(qiáng)大的工具,，通過 Sepmatix 8x SFC 色譜柱篩選系統(tǒng)與 Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)相結(jié)合,，可快速篩選出合適的色譜柱并線性放大至制備規(guī)格。SFC-50 的疊層進(jìn)樣功能,，不僅能實(shí)現(xiàn)無人值守自動(dòng)分離,，還可顯著提高分離效率，從而加快藥物合成研發(fā)的速度,。
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參考文獻(xiàn)
Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).
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PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.
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