利用噴霧干燥
實(shí)現(xiàn) mRNA-LNP 的氣管內(nèi)遞送
噴干應(yīng)用
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介紹
mRNA 疫苗是指將含有編碼抗原蛋白的 mRNA 導(dǎo)入人體,，直接進(jìn)行翻譯，形成相應(yīng)的抗原蛋白,，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,，達(dá)到預(yù)防免疫的作用（圖1）。
mRNA 疫苗的優(yōu)勢(shì)主要有：
研發(fā)周期短,、抗原選擇范圍廣,，任何可成蛋白的抗原序列均可被選擇
mRNA 疫苗的半衰期與免疫原性可通過(guò)修飾和遞送系統(tǒng)來(lái)人工調(diào)節(jié)，由于不進(jìn)入細(xì)胞核,，無(wú)感染或插入突變的風(fēng)險(xiǎn),，安全性更高
多種修飾后的 mRNA 更穩(wěn)定，在細(xì)胞質(zhì)中被高效攝取和表達(dá),；mRNA 疫苗具備自我佐劑特點(diǎn),，因此表現(xiàn)更強(qiáng)的免疫原性，有效性更高
可通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)快速,、廉價(jià)地大規(guī)模生產(chǎn) RNA 疫苗,，在掌了病毒基因序列后即可在 40 天內(nèi)完成疫苗樣品的生產(chǎn)制備
▲ 圖1. mRNA 疫苗通過(guò)轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞引起免疫
注射的 mRNA 疫苗被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)吞。
mRNA 脫離核內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,，被核糖體翻譯成蛋白質(zhì),。翻譯的抗原蛋白可以通過(guò)幾種方式刺激免疫系統(tǒng)。
細(xì)胞內(nèi)抗原被蛋白酶體復(fù)合物分解成更小的片段,，片段通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類(lèi)蛋白在細(xì)胞表面展示給細(xì)胞毒性T細(xì)胞,。
活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞溶解分子，如穿孔素和顆粒酶,，殺死被感染的細(xì)胞,。
此外，分泌的抗原可以被細(xì)胞攝取,，在核內(nèi)體內(nèi)降解，并通過(guò) MHC II 類(lèi)蛋白在細(xì)胞表面呈遞給輔助性T細(xì)胞,。
輔助性T細(xì)胞通過(guò)刺激 B 細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,，并通過(guò)炎癥因子激活吞噬細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞,，促進(jìn)循環(huán)病原體的清除,。BCR：B 細(xì)胞受體；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng),；TCR：T 細(xì)胞受體,。
隨著 COVID19 的全球大流行，mRNA 疫苗已經(jīng)作為一種新興的疫苗技術(shù)進(jìn)入市場(chǎng),，LNPs 是目前 mRNA 遞送時(shí)克服體內(nèi)給藥時(shí)的許多胞外和胞內(nèi)屏障的載體,。然而大多數(shù) LNP mRNA 疫苗需要嚴(yán)格控制的冷鏈基礎(chǔ)設(shè)施,。噴霧干燥是一種快速、可擴(kuò)展且連續(xù)的過(guò)程,，可生產(chǎn)室溫穩(wěn)定且適合吸入的細(xì)粉,，并可以通過(guò)噴霧干燥工藝參數(shù)來(lái)控制粉末的物理性質(zhì)。但噴霧干燥過(guò)程中,，LNP 也要承受剪切應(yīng)力,、液體界面膨脹和收集過(guò)程中熱脫水引起的應(yīng)力。以下分享阿斯利康應(yīng)用 BUCHI 小型噴霧干燥儀 B-290 實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)納米顆粒實(shí)現(xiàn)對(duì) mRNA 的氣管內(nèi)遞送,。
小型噴霧干燥儀 B-290
▲ 小型噴霧干燥儀 B-290
干燥參數(shù) | |
入口溫度 | 90℃ |
出口溫度 | 54℃ |
抽氣機(jī)效率 | 100% |
霧化氣流 | 1850 L/h |
進(jìn)料速率 | 2mL/min |
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方法
該團(tuán)隊(duì)首先關(guān)注了磷脂和緩沖液對(duì) LNP 本身溫度敏感性的影響,。由于 DSPC 的相變溫度(Tm)為 55℃，接近噴霧干燥器的出口溫度,，而 DOPE 是一種不飽和磷脂,，Tm 為 -16℃，可改善LNP的溫度敏感性,，并有研究發(fā)現(xiàn) DOPE 替代 DSPC 可以提高 mRNA 遞送效率[1],。LNP 中可電離脂質(zhì)的 pKa=7，因此 pH 值的大幅變化可能會(huì)導(dǎo)致顆粒結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化,，該團(tuán)隊(duì)測(cè)試了廣泛使用的 PBS 和 20 mM Tris 緩沖液的影響,。該團(tuán)隊(duì)將四種不同的 LNP 配方（DSPC PBS；DSPC Tris,；DOPE PBS,；DOPE Tris）在不同溫度范圍孵育以模擬LNP配方和噴霧干燥過(guò)程的溫度跨度。發(fā)現(xiàn) DOPE Tris 組在高達(dá) 75℃ 的溫度下仍保持穩(wěn)定,，并且在 80℃ 時(shí)僅損失約 20% 的 RNA,。
在噴霧干燥的溫度條件下更穩(wěn)定不等于能更好地承受?chē)婌F干燥過(guò)程，因此該團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了 DOPE Tris LNP 能更好地承受?chē)婌F干燥過(guò)程,。DOPE Tris 組在噴霧干燥和復(fù)溶 306Oi10 和 MC3 LNP 時(shí)均增強(qiáng)了顆粒穩(wěn)定性,。 Tris 緩沖液在噴霧干燥方面優(yōu)于PBS，雖然兩種緩沖液的 pH 值都會(huì)隨著溫度的升高而降低,，但 Tris 的變化率比 PBS 快 10 倍,，這意味著Tris緩沖液從 25°C 升至 37°C 時(shí) pH 將減少 0.3 個(gè)單位，而 PBS 僅減少 0.025 個(gè)單位,，pH 值的降低可能會(huì)確保RNA仍被封裝在LNP中,。作者還發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的LNP配方(DOPE Tris)顯著提高了評(píng)估了 LNP 在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 HepG2 和肺支氣管細(xì)胞系 16HBE 中的攝取，與 4°C 下儲(chǔ)存的液體 LNP 制劑相比,，通過(guò)噴霧干燥處理并在室溫下儲(chǔ)存的 LNP 具有更好的穩(wěn)定性,、更高的顆粒封裝效率以及更顯著的蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2）。
▲ 圖2. 通過(guò)修改配方,，以 DOPE 代替 DSPC,、Tris 緩沖液代替 PBS,，可以提高噴霧干燥后 LNP 的穩(wěn)定性
(A) 使用 DSPC 和 PBS 生產(chǎn)的 LNP 制劑對(duì)溫度升高敏感
(B) 當(dāng) DSPC 替換為 DOPE、PBS 替換為 Tris 時(shí),，噴霧干燥和重新分散后LNP顆粒的穩(wěn)定性顯著提高,。
(C) LNP 制劑在噴霧干燥(SD)后穩(wěn)定性提高,導(dǎo)致 mRNA 對(duì) HepG2 和 16HBE 細(xì)胞具有良好轉(zhuǎn)染效率。比例尺=100μm,。**P<0.01,、***P<0.001、****P< 0.0001,、n.s=不顯著,。
該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噴霧干燥 LNP 制劑時(shí),，在干燥塔內(nèi)可觀察到均勻的薄膜,，在旋風(fēng)分離器中可觀察到薄膜沉積物，這是因?yàn)樵跓o(wú)賦形劑的情況下,，噴霧干燥 LNP 制劑中每種成分的固化機(jī)制將根據(jù)其擴(kuò)散速率和溶解度而有所不同,，引起各組分分離。因此該團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了 LNP,、海藻糖,、三亮氨酸的比例[2]。發(fā)現(xiàn) LNP 與三亮氨酸的比例為 1:4 至 1:5 時(shí),，可以減少旋風(fēng)分離器中的粉末損失,，并進(jìn)一步提高復(fù)溶后的 mRNA 封裝效率，將 LNP 負(fù)載從 1.5% 增加到 5%,。噴霧干燥后,，通過(guò) SEM 分析粉末粒徑和表面結(jié)構(gòu)，通過(guò) CryoTEM 分析復(fù)溶的顆粒,。發(fā)現(xiàn)噴霧干燥后復(fù)溶的 LNP 樣品為尺寸范圍變化更大的致密小囊泡（圖3）,。
▲ 圖3. 噴霧干燥配方的優(yōu)化
(A) 粉末配方中三亮氨酸(LLL):LNP 比例的優(yōu)化可將旋風(fēng)分離器中的損失降至zui低，并隨著重構(gòu)后 RNA 封裝效率 (%EE) 的增加而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量zui大化,。
(B) 噴霧干燥產(chǎn)生 LNP 的掃描電鏡照片,。當(dāng)三亮氨酸(LLL)的濃度從 3% 增加到 15% 時(shí)，顆粒的形態(tài)逐漸從光滑的表面變成高度波紋狀的表面,。
(C) 新制 LNP 和噴霧干燥 LNP 代表性冷凍透射電子顯微鏡圖片。與新鮮 LNP 相比,，噴霧干燥 LNP 復(fù)溶后被包裹在致密的襯里,。比例尺 =200nm。
接下來(lái),，該團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了 mRNA LNP 粉末制劑在體內(nèi)的功能性遞送,。使用 Penn-Century Dry Powder Insufflator™-4 裝置對(duì)動(dòng)物進(jìn)行給藥,，該裝置可以將粉末直接輸送到大鼠的肺部。肺組織切片上的免疫組化(IHC)顯示出強(qiáng)烈的 eGFP 陽(yáng)性細(xì)胞染色,。這些細(xì)胞根據(jù)其定位,、形態(tài)和免疫熒光標(biāo)記被鑒定為細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、II 型肺細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞,。盡管僅識(shí)別出少數(shù) eGFP 陽(yáng)性細(xì)胞,，但這些陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)烈、且無(wú)背景噪點(diǎn),，表明 eGFP mRNA LNP 在噴霧干燥后吸入給藥,，可在肺部產(chǎn)生清晰的 eGFP 表達(dá)。
▲ 圖4. 肺中的體內(nèi)攝取和蛋白質(zhì)表達(dá)
(A) 大鼠肺示意圖
(B) 研究設(shè)計(jì)的示意圖,。
單次給藥后 24 小時(shí)或連續(xù)3天每日給藥后 24 小時(shí)處死大鼠,。給藥方式包括氣管內(nèi)(IT)滴注含有 eGFP mRNA LNP 的噴霧干燥制劑或安慰劑。
(C) 在右肺葉的肺勻漿中測(cè)量的 eGFP 蛋白水平
(D) 顯示 eGFP 陽(yáng)性細(xì)胞（紫色）的圖像
(E) IT 滴注單次(I和III）和 3 天重復(fù)(II和IV)給藥后 24 小時(shí)在大鼠左肺葉中檢測(cè)到的 eGFP(棕色),。eGFP 陽(yáng)性細(xì)胞（紫色）形態(tài)學(xué)上鑒定為細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 (D I) 和 II 型肺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 (D II),。在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞(E I)和 II 型肺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(E II)中鑒定出 eGFP mRNA (棕色)。
(F) eGFP 的免疫熒光標(biāo)記與 II 型肺細(xì)胞或巨噬細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合,，證實(shí)兩種細(xì)胞類(lèi)型都表達(dá) eGFP,。
(G) 左肺葉的組織病理學(xué)分析結(jié)果。
左上：來(lái)自對(duì)照大鼠的肺組織,，顯示沒(méi)有bing變,。
左下：治療 3 天的大鼠肺組織，顯示肺泡實(shí)質(zhì)中的實(shí)變區(qū)域,，代表炎癥病變（箭頭）,。
中圖：混合炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域的較高放大倍數(shù)，以較小的氣道和描繪肺泡管為中心,。
右圖：代表次級(jí)細(xì)支氣管上皮變化的圖像,。
3
結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究,，并成功通過(guò)配方優(yōu)化,，設(shè)計(jì)出了用于吸入的 mRNA LNP 噴霧干燥制劑。該制劑在經(jīng)過(guò)噴霧干燥和復(fù)溶后仍保持功能,，并可在體外和體內(nèi)有效遞送 mRNA,，能夠以臨床相關(guān)劑量水平實(shí)現(xiàn) LNP 的肺部給藥，在吸入式 mRNA 疫苗領(lǐng)域開(kāi)辟了新道路,，具有巨大前景,。
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參考文獻(xiàn)
Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).
Friis K P, Gracin S, Oag S, et al. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA[J]. Journal of Controlled Release, 2023, 363: 389-401.
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