不同類型化合物應(yīng)用的最佳條件
現(xiàn)如今,，F(xiàn)lash 及 Prep HPLC 色譜已經(jīng)成為許多分離應(yīng)用的常用方式,。就像我這種“廚房殺手”，黑暗料理界殿堂級(jí)人物,，在做飯時(shí),，如果鹽放多了都會(huì)不禁在想：是不是可以通過(guò)色譜分離的方式去除多余的鹽？
然而,，盡管這些分離技術(shù)是化學(xué)的基礎(chǔ),，但它們?nèi)匀浑y以捉摸，因?yàn)闆]有通用的一種方法可以適用于所有的樣品,。不同行業(yè)研究或感興趣的化合物是多樣性的,，這些化合物理化性質(zhì)差異性很大,。幸運(yùn)的是，前人們已經(jīng)通過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出了對(duì)不同分子類型化合物有效的純化條件,。所以,，如果您在進(jìn)行樣品分離時(shí)，對(duì)流動(dòng)相或固定相以及檢測(cè)器的選擇感到迷茫時(shí),。或許本篇文章會(huì)對(duì)您有些許的啟發(fā),。
第一階段是流動(dòng)相：樣品一定要可溶于待選溶劑,；其次是固定相：對(duì)您的樣品要有保留。有兩種色譜類型適用于這里：正相（NP）色譜和反相（RP）色譜,。這兩大色譜類型也是很多小伙伴在日?？蒲挟?dāng)中用到廣泛的。接下來(lái)是需要確定樣品溶解度,，判斷是否可以液體進(jìn)樣,？如果不可以，可以考慮固體上樣的方式（Flash色譜）,。最后一步是檢測(cè),，包括需要了解樣品是否具有紫外吸收，這將決定哪種檢測(cè)方法對(duì)特定化合物有效,，之前“小步”同學(xué)也有給大家分享過(guò)關(guān)于檢測(cè)器的選擇,，沒有看過(guò)的同學(xué)可以點(diǎn)擊這里，為了幫助快速進(jìn)行 Flash 和 Prep HPLC 應(yīng)用的開發(fā),，“小步”同學(xué)給出一些化合物類型適用的最佳條件,。
蛋白質(zhì)和多肽
蛋白質(zhì)由氨基酸組成，在溶液中形成與它們的生物功能密切相關(guān)的高度有組織三維結(jié)構(gòu),。多肽則是蛋白質(zhì)的小版本,，通常由含有 2-50 個(gè)氨基酸組成。
就流動(dòng)相而言,，它們大多溶于水,。反相（RP）色譜法適用于多肽或更小、更穩(wěn)定的蛋白質(zhì),，它們?cè)诩兓髸?huì)重新折疊,。這需要含有較少極性溶劑的水混合物，如乙腈,、異丙醇或乙醇,。乙腈是受歡迎的溶劑，因?yàn)樗讚]發(fā),，很容易從收集的餾分中去除,，除此之外,，它還具有低粘度和低紫外線吸收等特點(diǎn)。對(duì)于多肽的分離,，傳統(tǒng)的三氟乙酸(TFA)被添加到流動(dòng)相來(lái)進(jìn)行pH控制(緩沖)和離子配對(duì)(與相反帶電的離子團(tuán)形成復(fù)合物以增強(qiáng)保留),。
固定相是根據(jù)樣品的分子量和極性進(jìn)行選擇。Prep HPLC 色譜法由于其可以搭配更小粒徑尺寸色譜柱（柱效更高）,，所以成為分離極性相近或相似或化合物的常用純化方法,。對(duì)于 Prep HPLC 來(lái)講，樣品進(jìn)樣方式必須為液體進(jìn)樣,。所以對(duì)于疏水性樣品,，使用低級(jí)性溶劑（乙腈），親水性樣品使用乙醇或丙醇最佳,。對(duì)于高度親水的樣品,，可以適當(dāng)?shù)募尤胛⒘慷谆鶃嗧浚―MSO）或二甲基甲酰胺（DMF）提高整體溶解能力，這使得樣品可在最小溶劑體積內(nèi)溶解,，減小溶劑擴(kuò)散現(xiàn)象,。如果需要使用固體上樣，則更適用于 Flash 色譜,。
紫外檢測(cè)器通常作為檢測(cè)蛋白質(zhì)或多肽常用的方式,，檢測(cè)波長(zhǎng)一般設(shè)為 280nm。這一波長(zhǎng)已被證明特別有用,，因?yàn)榭梢灾苯訌牡鞍踪|(zhì)序列當(dāng)中預(yù)測(cè) 280nm 處的摩爾吸收系數(shù)(消光系數(shù)),，當(dāng)然，這只適用于含有色氨酸或酪氨酸殘基的蛋白質(zhì),。如果芳香族氨基酸含量低或沒有芳香族氨基酸,，則推薦使用 205nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
天然產(chǎn)物/提取物
活的有機(jī)體,，如植物,、微生物或動(dòng)物，通過(guò)初級(jí)或次級(jí)代謝途徑產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物,。初級(jí)代謝產(chǎn)物是生物體生長(zhǎng)所必需的,，次級(jí)代謝產(chǎn)物是初級(jí)代謝產(chǎn)物的最終產(chǎn)物。
流動(dòng)相的選擇基于提取時(shí)所使用的溶劑類型,，如果采用正相色譜（NP）純化,，則使用正己烷，石油醚,，二氯甲烷（DCM）,，乙酸乙酯（EtAc），或其他與水不互溶的溶劑；反相色譜（RP）則采用乙醇和水進(jìn)行提取,，分離純化流動(dòng)相一般為甲醇/水或乙腈/水,。對(duì)于固定相來(lái)說(shuō)，所有的 NP（硅膠,，二醇基,，氨基等）和 RP（C18 等）均可被使用。
天然產(chǎn)物的樣品成分通常非常復(fù)雜,，所以往往需要采用組合分離技術(shù)：通過(guò) Flash 色譜進(jìn)行前期預(yù)處理粗分,，再經(jīng)過(guò) Prep 色譜對(duì)樣品進(jìn)行單體化合物分離。
樣品的載樣量取決于天然產(chǎn)物提取物的體積,，通常來(lái)講提取物量都比較大,。樣品可以通過(guò)注射器或注射泵的方式注入到 Flash 色譜柱中，如果樣品體積過(guò)大,，則建議采取固體上樣的方式，因?yàn)槿绻軇w積過(guò)大會(huì)導(dǎo)致色譜峰譜帶變寬,，進(jìn)而影響分辨率,。Flash 色譜預(yù)分離的樣品后續(xù)可以在 Prep 上進(jìn)一步純化。
天然產(chǎn)物樣品的多樣性和未知性決定了其被檢測(cè)的方法,。通常來(lái)講,，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）與紫外檢測(cè)器（UV）的組合可以保證樣品檢測(cè)的全面性。對(duì)于 NP 色譜,，建議使用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),。
碳水化合物
碳水化合物可分為低分子量(單糖和雙糖)和更復(fù)雜的重碳水化合物(寡糖和多糖)。
單糖（葡萄糖）
二糖（蔗糖）
多糖（直鏈淀粉）
碳水化合物都是親水性的,，流動(dòng)相一般選擇水/甲醇或水/乙腈進(jìn)行搭配作為洗脫劑,。在 RP 條件下，使用 C18 填料作為固定相可以降低高極性碳水化合物的保留,。相反,，氨基柱已經(jīng)被證明是適合作為分離碳水化合物的固定相。因?yàn)樗幌?C18 那么非極性,。
上樣方式方面,，碳水化合物在 RP 條件下通常是可溶的，所以一般采用液體進(jìn)樣的方式進(jìn)行上樣,。
碳水化合物和脂類一樣,，缺乏發(fā)色團(tuán);目前，ELSD 是主要的檢測(cè)方法,。傳統(tǒng)上使用示差折光檢測(cè)器（RI),，低波長(zhǎng) UV (190-205 nm)，并通過(guò)薄層色譜進(jìn)行純化后分析。
小分子藥物
這些化合物被定義為有機(jī)化合物,，通常通過(guò)有機(jī)合成的方式獲得,。具有基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子，分子量一般在 0.1-1kDA 之間,。
Flash 和 Prep HPLC 通常都可以在 NP 和 RP 條件下條件,。小分子藥物的目標(biāo)通常是使用 RP，因?yàn)閷?duì)它們來(lái)說(shuō)水溶性是至關(guān)重要的,。NP 只能在 RP 不可能的情況下使用或后續(xù)通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾等方式使其能具有更高的成藥性,。
下表為正相色譜（NP）與反相色譜（RP）的對(duì)比：
上樣方式由樣品的極性和純化方式有關(guān)，高壓不銹鋼柱和 Flash 色譜柱可以液體和固體上樣（只能 Flash 色譜使用）,。液體注射進(jìn)樣是常用的方式,，但是如果樣品在方法的起始流動(dòng)相梯度時(shí)溶解性不好，則需要采取固體上樣,。
檢測(cè)器方面,，紫外檢測(cè)器依然是首要選項(xiàng)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的小分子藥物都具有紫外吸收,。然而,，在某些情況下，如果化合物紫外吸收較弱,，那么 NP 色譜所使用的有機(jī)溶劑會(huì)給其吸收帶來(lái)干擾,，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)人員對(duì)樣品分離效果的判斷。其他樣品可能會(huì)是半揮發(fā)性的,?；诖耍谑覝貤l件下使用 ELSD 檢測(cè)器是最適的,，因?yàn)楦邷貤l件下有機(jī)試劑的揮發(fā)順帶將化合物帶走的情況時(shí)有發(fā)生,，這會(huì)導(dǎo)致樣品檢測(cè)靈敏度降低。
維生素/脂質(zhì)
由于維生素/脂質(zhì)的性質(zhì)多樣性,，以及篇幅原因,。我們后續(xù)會(huì)專門出一期關(guān)于它們的文章，有相關(guān)研究的小伙伴可以持續(xù)關(guān)注哦,。
好了,，現(xiàn)在您應(yīng)該知道了不同類型化合物需要使用哪些色譜類型應(yīng)用方法了吧。希望這篇文章能對(duì)您接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)有所幫助,！
我是“小步”同學(xué),，我們下期再見！
長(zhǎng)按上方二維碼聯(lián)系我們
微信公眾號(hào)
步琦智慧實(shí)驗(yàn)室
淘寶旗艦店
瑞士步琦
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
4
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)