長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體作為難溶性藥物載體,，因具有體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)、靶向,、保護(hù),、高效低毒等特性,，極大地解決了脂質(zhì)體作為納米給藥載體的不足而倍受青睞，是很有發(fā)展前景的藥物載體,。
長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體又被稱(chēng)立體穩(wěn)定脂質(zhì)體,，它是在普通脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上加入一定比例的衍生物，使表面暴露出一些親水性的多糖或多羥基基團(tuán)等,，從而減少了與血漿中的成分結(jié)合,，增加了脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了藥物在血液中的作用時(shí)間,，使藥物有更充足的時(shí)間到達(dá)靶向部位,，增強(qiáng)藥物的治療效果。現(xiàn)在常用的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的修飾物有：神經(jīng)節(jié)苷脂GM1,、聚乙二醇(PEG),、非離子表面活性劑及其類(lèi)脂衍生物等。其中PEG及其類(lèi)脂衍生物因具有無(wú)免疫毒性且來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn),，目前已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)上常用的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體表面修飾物,，其主要包括PEG-DSPC、PEG-PE,、PEG-DSPE,、PEG-PC等。被修飾后的脂質(zhì)體可因PEG分子中大量的親水基團(tuán)與水結(jié)合構(gòu)成空間位阻,，降低吞噬細(xì)胞的破壞與吞噬的幾率,，延長(zhǎng)有效成分在血液中的滯留時(shí)間，使其血藥濃度較長(zhǎng)時(shí)間的作用于靶器官中,，使藥物的治療效果明顯提高,。長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體存在以下優(yōu)點(diǎn)：因脂質(zhì)體的粒徑為納米級(jí)別，注射長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體后被包裹的藥物更易透過(guò)細(xì)胞膜,，采用PEG對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾,，使脂質(zhì)體具備長(zhǎng)循環(huán)和立體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，對(duì)減少肝臟巨噬細(xì)胞對(duì)藥物的吞噬,，維持平穩(wěn)的血藥濃度,，提高藥物靶向性和生物利用度、延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間等具有重要作用和意義,。
為了使長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制劑更好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和臨床,，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)脂質(zhì)體制備工藝的進(jìn)行了深入的研究，研制出了多種的新型長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體,，包括長(zhǎng)循環(huán)磁性脂質(zhì)體,、長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體,、長(zhǎng)循環(huán)陽(yáng)離子脂質(zhì)體,、長(zhǎng)循環(huán)免疫脂質(zhì)體等,。新型長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的研制將為復(fù)方長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供新的思路與方向。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備：
Agilent-1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）,；
CP2250分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）,；
RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠)；
SHB-Ⅲ真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）,；
WST-NANO,；
高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；
5200H超聲波清洗器（上?？茘u超聲儀器有限公司）,；
DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器(浙江省樂(lè)清縣樂(lè)成電器廠)
實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果：
1三種長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備方法：
為了獲得粒徑較小的納米級(jí)的脂質(zhì)體，本實(shí)驗(yàn)選取了的三種常用制備脂質(zhì)體的方法并且聯(lián)合微射流均質(zhì)技術(shù)進(jìn)行比較,，分別為薄膜分散-微射流均質(zhì)法,、乙醇注入-微射流均質(zhì)法和逆相蒸發(fā)法-微射流均質(zhì)法，采用3種不同的方法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，通過(guò)比較制得的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率及粒徑大小對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),。
1.1 薄膜分散-微射流均質(zhì)法
精密稱(chēng)取蟾酥提純物5.20mg，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg,、10mg,，DSPE-mPEG20002mg，溶解于100mL氯仿中,，置于減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋蒸（45℃,，100r/min）直至氯仿蒸干。然后加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）于圓底燒瓶中進(jìn)行洗膜,，經(jīng)恒溫水化10min,，進(jìn)行超聲30min，采用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對(duì)所制備的蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì),，過(guò)0.22μm微孔濾膜整粒,，即為蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體溶液。
1.2 乙醇注入-微射流均質(zhì)法
精密稱(chēng)取蟾酥提純物物5.20mg,，成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg,、10mg，DSPE-mPEG20002mg,，溶于100mL乙醇作為有機(jī)相,，pH6.8的PBS緩沖液作為水相，在1200r·min－1的攪拌轉(zhuǎn)速下,，將有機(jī)相勻速緩慢滴入50℃保溫水相中,，繼續(xù)攪拌2h，揮去乙醇,，超聲30min,，用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對(duì)所得混懸液進(jìn)行均質(zhì),，過(guò)0.22μm微孔濾膜整粒，即得蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體混懸液,。
1.3 逆向蒸發(fā)-微射流均質(zhì)法
精密稱(chēng)取蟾酥提純物5.20mg加入到50mLpH7.0的PBS緩沖液,，作為水相，精密稱(chēng)取成膜材料大豆卵磷脂和膽固醇分別為40mg,、10mg,，DSPE-mPEG20002mg，加入50mL氯仿使其溶解,。將水相加入到有機(jī)相中,，超聲處理5min，得W/O乳劑,置減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于恒溫45℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,，得稠厚的膠狀物,，于干燥箱中室溫條件下放置4h，加入50mLpH6.8的PBS緩沖溶液,，洗膜,，進(jìn)行超聲30min，采用genizer微射流均質(zhì)機(jī)對(duì)所制備的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì),，過(guò)0.22μm微孔濾膜整粒,，即得蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體混懸液。
結(jié)果
1. 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體外觀
采用超速離心法測(cè)定制備的蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體得包封率,，14000r/min離心30min,，分離游離藥物和含藥脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率和粒徑,。通過(guò)比較所測(cè)得的包封率和粒徑大小來(lái)選取制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體方法,，具體結(jié)果見(jiàn)下表1。
制備方法對(duì)長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響
從上表中可以看出,，由于均采用與微射流均質(zhì)法聯(lián)合應(yīng)用,，三種制備方法所制得的蟾酥長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的粒徑差別并不明顯，而測(cè)得的包封率有較大的差別,，采用薄膜分散法制備的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率最大,，其次是乙醇注入法，而逆向蒸發(fā)法最小,。三種方法均結(jié)合微射流均質(zhì)法測(cè)得的粒徑最小的為薄膜分散法,，綜合包封率和粒徑2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終最終選擇薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體
長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝單因素考察
本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，以包封率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),，以形態(tài)外觀為參考，選取有機(jī)溶劑的種類(lèi)、磷脂與膽固醇的比例,、藥脂比,、DSPE-mPEG2000的用量、水化溫度,、超聲時(shí)間、微射流壓力作為單因素考察,。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,，選取影響較大的因素作為主要因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法對(duì)蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的工藝進(jìn)行優(yōu)化,。本
其中：微射流均質(zhì)壓力對(duì)包封率的影響
固定制備條件：卵磷脂：蟾酥提取物（7:1）,；卵磷脂：膽固醇（3:1）；超聲時(shí)間40min,；水化溫度65℃,；加入50mL的氯仿有機(jī)溶劑；磷酸鹽緩沖液PH=6.8,；加入5%DSPE-mPEG2000,；減壓旋蒸溫度43℃。變化條件：微射流壓力,，分別為60MPa,、80MPa、100MPa,、120MPa,、140MPa。
方法：采用薄膜分散法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，結(jié)合微射流均質(zhì)法減小其粒徑,，測(cè)定其包封率，具體結(jié)果見(jiàn)下表2,。
不同微射流壓力對(duì)包封率的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，微射流儀壓力對(duì)包封率也存在著影響，當(dāng)壓力超過(guò)100MPa時(shí),，脂質(zhì)體包封率減小,，原因可能是過(guò)大的壓力導(dǎo)致脂質(zhì)體破壞，破乳所致,，因此本實(shí)驗(yàn)選擇微射流儀壓力為100MPa,。
其他單因素檢測(cè)細(xì)節(jié)：略
星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體處方與工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲時(shí)間（X1）,、卵磷脂：蟾酥提取物（X2）,、卵磷脂：膽固醇（X3）對(duì)蟾酥長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率有較大影響。因此在單因素實(shí)驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上,，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面原理,，將較為顯著的3個(gè)因素作為自變量,，z高水平設(shè)定為：X1為50min；X2為9:1,；X3為4:1,，z低水平設(shè)定為：X1為30min；X2為5:1,；X3為2:1,，以包封率（Y）為因變量，優(yōu)化蟾酥長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的處方與工藝,。
Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果分析應(yīng)用DesignExpert8.0軟件對(duì)表3-11工藝優(yōu)化試驗(yàn)因素水平的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,，得二次多項(xiàng)回歸模型方程Y=86.16－0.33A—1.18B+1.60C－0.42AB+0.55AC+1.38BC－1.50A2－2.09B2－1.50C2，R2=0.9518,。模型的R2與1較接近,，說(shuō)明通過(guò)二次回歸得到的模型與試驗(yàn)擬合較好。同時(shí),，響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果顯示：模型F=15.37,，P0.05)，不顯著,，因此二次模型成立,。
影響脂質(zhì)體包封率的主要因素分析包封率模型(Y)回歸方程的方差分析表明B，C,，BC,，A2，B2,，C2項(xiàng)達(dá)極顯著水平(P<0.01),，交互項(xiàng)AB和AC的P分別為0.3189，0.2022,，均大于0.05,，所以交互項(xiàng)AB和AC對(duì)顆粒的一次成型率沒(méi)有顯著性影響。通過(guò)F值大小可以判斷,，選取的3個(gè)主要因素對(duì)包封率影響大小依次為,，磷脂：膽固醇（X3）>磷脂：蟾酥提取物（X2）>超聲時(shí)間（X1）
優(yōu)化處方驗(yàn)證蟾酥長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的最佳制備工藝為：
精密稱(chēng)取蟾酥提取物20mg，大豆卵磷脂140mg,，膽固醇40mg,，DSPE-mPEG20009mg，溶于100mL氯仿中,，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓旋蒸（43℃,，100r/min），有機(jī)溶劑氯仿全部除去的同時(shí)，燒瓶?jī)?nèi)壁上會(huì)形成一層白色薄膜,。此時(shí)加入50mLPBS緩沖液（pH6.8）洗膜,，再依次經(jīng)60℃恒溫?cái)嚢杷?/font>20min，超聲40min,，設(shè)定genizer微射流均質(zhì)機(jī)壓力為100MPa,，對(duì)所得混懸液進(jìn)行均質(zhì)，混懸液于14000r/min離心1h,，分離游離藥物和含藥脂質(zhì)體,，測(cè)定其包封率。根據(jù)最佳制備工藝制備三批蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，分別測(cè)定華蟾酥毒基與脂蟾毒配基總含量的包封率。具體結(jié)果見(jiàn)表3,。
工藝驗(yàn)證結(jié)果
討論與小結(jié)
脂質(zhì)體制備方法有多種,，實(shí)驗(yàn)中選用薄膜分散法、乙醇注入法,、逆向蒸發(fā)法結(jié)合微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，以包封率和粒徑作為考察指標(biāo)，選取理想的制備方法,。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，選取的三種制備方法對(duì)粒徑結(jié)果影響較小，而對(duì)包封率的影響較為明顯,。采用薄膜分散法制備的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體包封率最高,，其次是乙醇注入法，z低的是逆向蒸發(fā)法,，因?yàn)榇朔▽?duì)水溶性藥物包封率較高,，而蟾酥中的華蟾毒配基和脂蟾毒配基于脂溶性成分，因此逆向蒸發(fā)法制得的蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的包封率低,。且考慮到薄膜分散法工藝簡(jiǎn)單,，測(cè)定包封率較高，因此選用薄膜分散法制備脂質(zhì)體,，但僅使用薄膜分散法制得的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體粒徑過(guò)大,，若結(jié)合微射流均質(zhì)法能使脂質(zhì)體的粒徑減小，有利于均勻分散,。因此,，最終選擇薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體。
本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行單因素考察蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的處方與工藝,，對(duì)有機(jī)溶劑種類(lèi)的選擇,、磷脂與膽固醇的比例、藥脂比、超聲時(shí)間,、水化溫度,、DSPE-mPEG2000用量、不同pH值水化介質(zhì)的選擇,、微射流壓力對(duì)包封率的影響進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂與膽固醇的比例,、藥脂比,、超聲時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響較大，而水化溫度,、DSPE-mPEG2000用量,、不同pH值水化介質(zhì)的選擇、旋蒸溫度對(duì)包封率的影響較小,，因此選取影響較大的3個(gè)因素確定影響范圍,，通Box-Behnken響應(yīng)面法的進(jìn)行蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體工藝優(yōu)化。
本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上,，選用薄膜分散—微射流均質(zhì)法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體,，以包封率為主要指標(biāo)，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)篩選出蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的最佳處方工藝和制備工藝,。工藝驗(yàn)證結(jié)果表明：測(cè)得包封率和載藥量較高,，且粒徑也符合肝靶向要求，說(shuō)明采用此法制備蟾酥提取物長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體工藝穩(wěn)定,，科學(xué)合理,。
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