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在WB過程中從SDS-PAGE膠上轉移蛋白至膜上是非常關鍵的步驟,！優(yōu)化轉移時間往往需要實驗多次,，下面就講幾條關于如何保證蛋白*轉移的小技巧，適合新手參考:

使用預染的marker 預染marker不僅能夠直觀的觀察到跑膠情況,，而且在轉移過程中也是很好的工具,，在完成印跡后觀察膜上的 marker ,，看是否所有條帶都已經(jīng)轉移至膜上。

在轉印裝置中加兩塊膜 小分子量的蛋白轉移的比較快,，而為保證大分子蛋白的轉印,，長時間的轉印可能使小分子蛋白透過膜，因此,，可以加入兩塊膜,，如果能在第二塊膜上檢測到小分子蛋白，說明轉印時間過長,。

在轉印后對膠染色 如果轉印時間不夠優(yōu)化,，通過對膠染色，在膠上能夠觀察到未轉移*的蛋白,，這種情況在轉印大分子蛋白是常見,，使用銀染或者考馬斯亮藍的方法都可以。

二,、Western blot轉印的優(yōu)化

從SDS凝膠中進行Western蛋白轉印的優(yōu)化需要對一系列參數(shù)進行考慮,。目的是轉印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉移到轉印膜上。進行轉印需要一定程度的優(yōu)化,，尤其是對于大分子量和小分子量蛋白,。

轉印后，凝膠上應不殘留或殘留很少的蛋白,?？梢栽谵D印后進行染色進行檢測。轉移出凝膠的蛋白應該僅在接觸凝膠的膜的一面可見,。如果有懷疑,，在轉印時使用第二個"支持膜"，你可以在轉膜后染色,，以檢查是否有穿膜的跡象,。如果發(fā)現(xiàn)蛋白殘留在凝膠上而且膜的結合性很差，可以考慮下列因素：

SDS vs 甲醇

在多數(shù)轉印實驗步驟中都使用SDS和甲醇,。但兩者對于成功的轉印有相反的作用,，需要根據(jù)欲轉印蛋白的性質加以優(yōu)化。

SDS對于蛋白的遷移是必要的,，尤其有助于大分子量蛋白從凝膠上的轉移,。但由于膜結合需要疏水相互作用，SDS過多會抑制結合,，尤其對于硝酸纖維素膜。作為一個一般性的規(guī)則,，如果膜的結合力有效,，但蛋白仍舊殘留在凝膠上,，在轉印緩沖液中加入 0.1％SDS會促進*轉印。但另一方面,，甲醇通過在蛋白上剝離SDS,，促進蛋白和膜的疏水結合。一般在轉印緩沖液中加入20％的甲醇會增加硝酸纖維素膜的結合能力,。

凝膠濃度

丙烯酰胺濃度越低,，蛋白越容易轉移下來。選擇可以分離蛋白的濃度zui低的凝膠,。梯度膠適用于轉印一系列不同大小的蛋白,，因為凝膠的孔與不同大小的蛋白匹配良好。

凝膠厚度

蛋白比較易于從薄膠上轉移下來,，所以如果上樣體積允許,，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。

電場（電壓×時間）

如果電壓過低而且轉印時間過短,，部分蛋白會殘留在凝膠上,。如果電壓過高，小蛋白會在結合到膜上前透膜而出,。如果按建議的條件轉印后有蛋白殘留在膠上,，增加電壓可能會有幫助，但不要超過5V,。

膜的類型

蛋白結合到硝酸纖維素膜上主要通過疏水鍵,。PVDF膜比硝酸纖維素膜更疏水，在轉印過程中結合蛋白更緊密,，可以耐受更多的SDS,。目前，PVDF膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴謹?shù)姆忾]條件,，其適用于蛋白印跡,。尼龍膜通過疏水和靜電相互作用結合，其SDS耐受度甚至高于PVDF膜,，但也需要更嚴謹?shù)姆忾]條件,，主要建議用于Northern和 Southern。