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1 質(zhì)粒DNA提取

提取質(zhì)粒的時(shí)候,，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵,，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間,，是空調(diào)吹熱風(fēng),，或是37度溫箱放長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間，我試過(guò)室溫經(jīng)過(guò)一夜,，酶切很好,。

將amp濃度提高到200ug/ml，下班前接種,，次日一早收獲菌體,，此時(shí)OD雖然不高，質(zhì)粒豐度卻不一般,。菌體量少些,，操作體積（管數(shù)）也小（少）,。

手提質(zhì)粒,，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，再注意一下手法,，嚴(yán)格按照參考書上面的操作的話,，提出的質(zhì)粒不比任何質(zhì)粒提取試劑盒差，我感覺(jué)好像還好一點(diǎn),，我就用過(guò)一次試劑盒,，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒(méi)用過(guò)了,。

2 Western Blot

做western blot的時(shí)候,，大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度,，封閉時(shí)間,，曝光時(shí)間等等，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠,、轉(zhuǎn)膜,，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間,。其實(shí)*沒(méi)有必要這樣,。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干,，裁減成小塊,，保存起來(lái)，用的時(shí)候取出一塊,，沒(méi)有任何影響,。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來(lái)說(shuō)，節(jié)約了大量的時(shí)間,。

做western blot 轉(zhuǎn)膜時(shí),，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置,，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶,，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚,，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了,。不過(guò)要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防maker失去參照價(jià)值,。

器具的清潔非常重要,，開(kāi)始做前，為了安全,，尤其是裝膠的厚薄玻璃板,，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍,，然后用去離子水沖洗一遍,。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。

配膠現(xiàn)用現(xiàn)配,，先配下層膠（分離膠）,，后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻,，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可,。

3 緩沖液和培養(yǎng)基配置

（1）將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲(chǔ)存，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合,，補(bǔ)加水稀釋即可,；

（2）配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g,，哪個(gè)要10個(gè),，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量,，如配LB時(shí)，在NaCl瓶外注明10 g/L,，yeast 5 g/L,，tryton 10 g/L等，很方便,，不需要每次配之前臨時(shí)翻書,。

4 PCR

在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣,，可以將其配置類似kit的形式,，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液（100次反應(yīng)）,，其中含buffer,，Mg2＋，dNTPs,，但不含引物和Taq酶,，然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在－20度，在需要的時(shí)候拿出融開(kāi),，然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù),，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝,，這樣做的好處如下：

（1）可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間,，可早點(diǎn)收工，看球,；

（2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能,；

（3）大大減少PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

5 酶切

如果是要做酶切,，提質(zhì)粒的zui后一步是用水溶解DNA,，因?yàn)?/span>TE里面的離子會(huì)影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體,，選擇帶有外源片段的質(zhì)粒,，是否酶切*，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷,?？召|(zhì)粒單切*和雙切*在分子量上差異不大。

在做酶切時(shí),，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液,，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù),，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大,，加入buffer,、酶、水,，質(zhì)粒欄空缺,，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切,，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽(yáng)性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：

（1）各反應(yīng)成分均一,；

（2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用,；

（3）節(jié)省時(shí)間。

6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

有時(shí)候*天涂的轉(zhuǎn)化平板,、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)成的菌落比較大（1~2毫米以上,，BL21就長(zhǎng)得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定,。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基）,，50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘,，加40微升TE抽提,，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液,。提取的質(zhì)?？梢灾苯佑糜陔娪竞兔盖小＿@樣操作,，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟,，至少節(jié)省6~8小時(shí)的時(shí)間。但是,，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果,，不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)。

轉(zhuǎn)化時(shí)一定要做一個(gè)宿主菌的對(duì)照,，即重組質(zhì)粒涂板后再用宿主菌涂響應(yīng)抗性的平板，以確定第二天長(zhǎng)出來(lái)的克隆是否正確,，我當(dāng)時(shí)做了三次轉(zhuǎn)化之后才發(fā)現(xiàn)不成功竟然是由于BL21可以在Amp（+）的平板上面生長(zhǎng),。

7 蛋白質(zhì)的表達(dá),、分離,、純化

當(dāng)?shù)鞍状罅康谋磉_(dá)時(shí),，包含體的形成幾乎是不可避免的,，而且很難通過(guò)改變一些誘導(dǎo)條件來(lái)改變，zui有效的辦法就是換表達(dá)系統(tǒng),，所以如果時(shí)間還充分的話,，可以嘗試一下,，如果時(shí)間較短了,，還是安心的座包含體蛋白的處理算了,，而且變性之后的蛋白通過(guò)一些方法復(fù)性率也可以達(dá)到60％以上,。

8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆

引物設(shè)計(jì)主要是要注意以下幾個(gè)事項(xiàng)：

（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu),；

（2）反向配對(duì),；

（3）GC含量（40－60%）,；

（4）退火溫度（45－65度）；

（5）引物長(zhǎng)度（18－27bp）,；

（6）3' 端是C,、G（提高結(jié)合度）；

（7）引物在序列中的錯(cuò)配位點(diǎn),。

大致就這幾個(gè)方面,，重要性依次降低,，由其是3' 端不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

那么你說(shuō)你這段能不能設(shè)計(jì)引物呢,？其實(shí)設(shè)計(jì)引物都只是好中選優(yōu)的問(wèn)題。

9 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)

（1）可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時(shí)到1小時(shí)，這樣溫度和ph值都已經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)了。

（2）為防止凍存管在升溫時(shí)爆裂等，可以在放入水浴前就實(shí)現(xiàn)在超凈臺(tái)里把蓋子擰松一下然后再擰上,。從液氮罐里拿出來(lái)不是說(shuō)一定要分秒必爭(zhēng)地放入水浴,。細(xì)胞從液氮的零下1百多度升到比如負(fù)八十這個(gè)過(guò)程對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損害,。有足夠的時(shí)間handle這些。只不過(guò)一旦細(xì)胞化了，就應(yīng)該爭(zhēng)分奪秒地把它放入培養(yǎng)液了,，主要是為了稀釋DMSO,。常溫下高濃度DMSO對(duì)細(xì)胞的損害比較大,。

（3）水浴溫度40℃應(yīng)該也沒(méi)問(wèn)題,，但正規(guī)的protocol上從來(lái)都只說(shuō)37℃。反正應(yīng)該相差不大,，但不能太高了,。另外，不必等細(xì)胞全化了再?gòu)乃±锶〕鰜?lái),。只要冰塊浮起來(lái)了就差不多了,。我一般zui多水浴不超過(guò)1.5分鐘,。然后經(jīng)過(guò)噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過(guò)去了,。每次都還有沒(méi)化的。先把已經(jīng)融解的部分吸到培養(yǎng)瓶里,，再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶里吸些培養(yǎng)液到凍存管里,，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養(yǎng)瓶里,。

10 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

（1）RT-PCR有兩種做法

條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行,；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想,，條帶特異性強(qiáng)且無(wú)拖尾現(xiàn)象,，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行，當(dāng)然也可能是我買的kit不太好,。（promega）,。

（2）RT-PCR應(yīng)具備的條件

高質(zhì)量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）,；引物的（產(chǎn)物短點(diǎn)）,；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好，但我發(fā)現(xiàn)其實(shí)很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的*一樣）；體系的均一性等,。

（3）RACE

我做過(guò)RACE（3’RACE是寶生物的Kit,；5‘RACE是Gibico），但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個(gè)同源基因的3‘RACE時(shí)卻怎么也P不出來(lái),，這兩個(gè)基因是由同一對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的,，其中一個(gè)已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法），而另一個(gè)基因的3’UTR卻增么也擴(kuò)不出來(lái),，我推測(cè)是不是該基因的3‘UTR太長(zhǎng)的緣故,。

（來(lái)源：丁香園）

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