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送給生物實(shí)驗(yàn)室達(dá)人的10個(gè)“偷懶”技巧
閱讀：384 發(fā)布時(shí)間：2015-4-141 質(zhì)粒DNA提取
提取質(zhì)粒的時(shí)候，zui后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵,，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性因素,。所以這一步盡量揮發(fā)長一點(diǎn)時(shí)間，是空調(diào)吹熱風(fēng),，或是37度溫箱放長一點(diǎn)的時(shí)間,，我試過室溫經(jīng)過一夜，酶切很好,。
將amp濃度提高到200ug/ml,，下班前接種,，次日一早收獲菌體，此時(shí)OD雖然不高,，質(zhì)粒豐度卻不一般,。菌體量少些，操作體積（管數(shù)）也?。ㄉ伲?。
手提質(zhì)粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提,，再注意一下手法,，嚴(yán)格按照參考書上面的操作的話，提出的質(zhì)粒不比任何質(zhì)粒提取試劑盒差,，我感覺好像還好一點(diǎn),，我就用過一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好,，以后再也沒用過了,。
2 Western Blot
做western blot的時(shí)候，大家往往會(huì)摸索一抗,、二抗的濃度，封閉時(shí)間,，曝光時(shí)間等等,，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜,，甚至重新提蛋白,，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)*沒有必要這樣,。一次轉(zhuǎn)膜后,，將PVDF膜晾干，裁減成小塊,，保存起來,，用的時(shí)候取出一塊，沒有任何影響,。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來說,，節(jié)約了大量的時(shí)間。
做western blot 轉(zhuǎn)膜時(shí),，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間,，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶,，方便的很,。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚,，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了,，以防maker失去參照價(jià)值,。
器具的清潔非常重要，開始做前,，為了安全,，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗,，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍,，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用,。
配膠現(xiàn)用現(xiàn)配,，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠）,，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻,，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。
3 緩沖液和培養(yǎng)基配置
（1）將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲(chǔ)存,，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合,，補(bǔ)加水稀釋即可；
（2）配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量,，如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g,，哪個(gè)要10個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量,，如配LB時(shí),，在NaCl瓶外注明10 g/L，yeast 5 g/L,，tryton 10 g/L等,，很方便，不需要每次配之前臨時(shí)翻書,。
4 PCR
在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定,，每次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式,，按你需要的反應(yīng)體系列表,，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液（100次反應(yīng)），其中含buffer,，Mg2＋,，dNTPs，但不含引物和Taq酶,，然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在－20度,，在需要的時(shí)候拿出融開,，然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物,，混勻后分裝,，這樣做的好處如下：
（1）可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工,，看球,；
（2）避免每次反應(yīng)加樣不均的可能；
（3）大大減少PCR假陽性的產(chǎn)生,。
5 酶切
如果是要做酶切,，提質(zhì)粒的zui后一步是用水溶解DNA，因?yàn)?/span>TE里面的離子會(huì)影響酶切的效率,。
雙酶切制備克隆插入片段的載體,，選擇帶有外源片段的質(zhì)粒，是否酶切*,，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷,。空質(zhì)粒單切*和雙切*在分子量上差異不大,。
在做酶切時(shí),，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系,，算好需要的反應(yīng)數(shù),，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer,、酶、水,，質(zhì)粒欄空缺,，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNA酶切,，這樣做的好處如下,，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：
（1）各反應(yīng)成分均一；
（2）可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用,；
（3）節(jié)省時(shí)間,。
6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
有時(shí)候*天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長成的菌落比較大（1~2毫米以上,，BL21就長得快）,，下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基）,，50微升酚/氯仿懸浮菌體,，放置兩分鐘,，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次,，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液,。提取的質(zhì)粒可以直接用于電泳和酶切,。這樣操作,，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省6~8小時(shí)的時(shí)間,。但是,，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者未必能夠很方便地重復(fù),。
轉(zhuǎn)化時(shí)一定要做一個(gè)宿主菌的對(duì)照,，即重組質(zhì)粒涂板后再用宿主菌涂響應(yīng)抗性的平板，以確定第二天長出來的克隆是否正確,，我當(dāng)時(shí)做了三次轉(zhuǎn)化之后才發(fā)現(xiàn)不成功竟然是由于BL21可以在Amp（+）的平板上面生長,。
7 蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離,、純化
當(dāng)?shù)鞍状罅康谋磉_(dá)時(shí),，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過改變一些誘導(dǎo)條件來改變,，zui有效的辦法就是換表達(dá)系統(tǒng),，所以如果時(shí)間還充分的話，可以嘗試一下,，如果時(shí)間較短了,，還是安心的座包含體蛋白的處理算了，而且變性之后的蛋白通過一些方法復(fù)性率也可以達(dá)到60％以上,。
8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆
引物設(shè)計(jì)主要是要注意以下幾個(gè)事項(xiàng)：
（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu),；
（2）反向配對(duì)；
（3）GC含量（40－60%）,；
（4）退火溫度（45－65度）,；
（5）引物長度（18－27bp）；
（6）3' 端是C,、G（提高結(jié)合度）,；
（7）引物在序列中的錯(cuò)配位點(diǎn)。
大致就這幾個(gè)方面,，重要性依次降低,，由其是3' 端不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
那么你說你這段能不能設(shè)計(jì)引物呢？其實(shí)設(shè)計(jì)引物都只是好中選優(yōu)的問題,。
9 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)
（1）可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里,，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時(shí)到1小時(shí),，這樣溫度和ph值都已經(jīng)細(xì)胞生長了,。
（2）為防止凍存管在升溫時(shí)爆裂等，可以在放入水浴前就實(shí)現(xiàn)在超凈臺(tái)里把蓋子擰松一下然后再擰上,。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭(zhēng)地放入水浴,。細(xì)胞從液氮的零下1百多度升到比如負(fù)八十這個(gè)過程對(duì)細(xì)胞沒有損害。有足夠的時(shí)間handle這些,。只不過一旦細(xì)胞化了,，就應(yīng)該爭(zhēng)分奪秒地把它放入培養(yǎng)液了，主要是為了稀釋DMSO,。常溫下高濃度DMSO對(duì)細(xì)胞的損害比較大,。
（3）水浴溫度40℃應(yīng)該也沒問題，但正規(guī)的protocol上從來都只說37℃,。反正應(yīng)該相差不大,，但不能太高了。另外,，不必等細(xì)胞全化了再從水浴里取出來,。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般zui多水浴不超過1.5分鐘,。然后經(jīng)過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了,。每次都還有沒化的。先把已經(jīng)融解的部分吸到培養(yǎng)瓶里,，再從培養(yǎng)瓶里吸些培養(yǎng)液到凍存管里,，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養(yǎng)瓶里,。
10 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）
（1）RT-PCR有兩種做法
條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行,；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想,，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行,，當(dāng)然也可能是我買的kit不太好,。（promega）。
（2）RT-PCR應(yīng)具備的條件
高質(zhì)量的RNA（保留后可做5‘,，3’RACE）,；引物的（產(chǎn)物短點(diǎn)）；若涉及粗略定量的話還應(yīng)考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內(nèi)標(biāo)分子更好,，但我發(fā)現(xiàn)其實(shí)很不容易將RNA的濃度以及內(nèi)標(biāo)分子的表達(dá)量調(diào)整的*一樣）,；體系的均一性等,。
（3）RACE
我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico）,，但現(xiàn)在再進(jìn)行另一個(gè)同源基因的3‘RACE時(shí)卻怎么也P不出來,，這兩個(gè)基因是由同一對(duì)引物擴(kuò)增出來的，其中一個(gè)已經(jīng)獲得了全序列（RACE的方法）,，而另一個(gè)基因的3’UTR卻增么也擴(kuò)不出來,，我推測(cè)是不是該基因的3‘UTR太長的緣故。
（來源：丁香園）
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