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技術(shù)文章
2014Z受歡迎的PCR方法相關(guān)論文
閱讀：546 發(fā)布時(shí)間：2014-12-16今天,，Biotechniques介紹了2014年在該發(fā)表的5篇zui有趣和zui有用的PCR方法相關(guān)文章。
PCR是現(xiàn)代分子生物學(xué)中的一種基本技術(shù),，所以它的任何創(chuàng)新或改進(jìn)都受到研究人員的極大歡迎。BioTechniques的編輯們一直都非常喜歡PCR方法,，我們很高興看到,，2014年帶來(lái)了新技術(shù)的強(qiáng)大選擇。在這里,，我們介紹了在過(guò)去一年中發(fā)表的5篇PCR方法相關(guān)論文,，范圍很廣，從基本老式PCR反應(yīng)有效性和特異性的改進(jìn)，到技術(shù)如數(shù)字PCR,。
1,、 一種強(qiáng)大的耐熱DNA聚合酶鏈置換活性可顯著改善DNA擴(kuò)增結(jié)果
誰(shuí)不喜歡一種多功能的工具呢？當(dāng)你可以用有些奇怪但很方便,、孩子喜歡的叉勺時(shí),，為什么還去用勺子和叉子呢？在8月刊的BioTechniques,，Ignatov等人描述了DNA聚合酶的叉勺等價(jià)物,，一種可用于常規(guī)PCR反應(yīng)以及等溫?cái)U(kuò)增的DNA聚合酶。直到現(xiàn)在,，這兩種擴(kuò)增方法還需要非常不同類型的DNA聚合酶：對(duì)于PCR來(lái)說(shuō),，一種耐熱DNA聚合酶（如Taq酶），可以經(jīng)受住每一個(gè)PCR循環(huán)中的熱變性步驟,；對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增來(lái)說(shuō),，一種DNA聚合酶如Bst，具有很強(qiáng)的鏈置換活性,，使DNA鏈分開而代替熱變性,。Ignatov和同事們證明，一種新型Taq DNA聚合酶突變體,，具有很強(qiáng)的鏈置換活性,，稱為SD DNA聚合酶，不僅可用于PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）以及zui近描述的聚合酶鏈置換反應(yīng)方法,，而且能夠改善靈敏度和效率,，即使在困難的情況下，例如長(zhǎng)片段PCR或GC富集模板的擴(kuò)增,。這種多用途的新型DNA聚合酶應(yīng)該是對(duì)DNA擴(kuò)增酶工具箱的一種受歡迎的補(bǔ)充,。
2、 牛凝血酶可提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的效率和特異性
當(dāng)PCR不能正常工作,，或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體而不是預(yù)期的擴(kuò)增子時(shí),，這是非常令人沮喪的。多年來(lái),，研究人員已經(jīng)在PCR反應(yīng)中添加了許多化合物,，以提高DNA擴(kuò)增的特異性和效率。這些添加物范圍很廣,，從小的有機(jī)分子（例如甘油和甜菜堿）到非離子型洗滌劑（如Triton X-100和Tween,，到蛋白質(zhì)如BSA）,。不幸的是,，每一種添加物只在一組特定的條件下改善PCR擴(kuò)增結(jié)果。真正理想的狀態(tài)是，一種PCR增強(qiáng)劑在盡可能多的不同情況下都可以起作用,，Xinhui Lou及其同事偶然發(fā)現(xiàn)了牛凝血酶（BT）,。他們?cè)?2月份發(fā)表的論文中描述道，BT在低于BSA 20到180倍的濃度,，能改善范圍廣泛的模板DNA的PCR特異性和效率,，同時(shí)還能夠緩解納米材料（如氧化石墨烯和金納米粒子）引起的抑制作用。
3,、 在PCR之前線性擴(kuò)增模板可改善低模板DNA的結(jié)果
一種重要的PCR擴(kuò)增是,，擴(kuò)增少量的源DNA，為法醫(yī)或古DNA研究提供足夠的材料,。然而,，一個(gè)主要的問(wèn)題是，提供足夠多的DNA,，往往必須擴(kuò)大PCR循環(huán)的次數(shù),，以用于基因型分型應(yīng)用，這會(huì)引起隨機(jī)抽樣效應(yīng),，導(dǎo)致等位基因或位點(diǎn)脫離或雜合等位基因丟失,，從而使基因型分型很難或者不可能。作為一種解決方案,，Kelly Griesdale和Angela van Daal假設(shè),，在PCR擴(kuò)增之前，與單獨(dú)PCR擴(kuò)增相比,，少量目標(biāo)DNA的線性擴(kuò)增用于基因型分型,，將會(huì)以一種更具代表性的方式，增加模板的數(shù)量,。使用這種方法,，他們能夠證明，與不用pre-PCR線性擴(kuò)增步驟的樣品相比,，從越來(lái)越少的人類基因組DNA的多重STR基因型分型重新獲得的等位基因總數(shù)顯著提高,。
4、 利用QIAshredder而不是限制性內(nèi)切酶為液滴數(shù)字PCR準(zhǔn)備DNA的優(yōu)點(diǎn)
作為PCR的版本,，數(shù)字PCR已經(jīng)成為定量分析高準(zhǔn)確度靶序列的一種日益流行的方法,。該技術(shù)的一個(gè)重要方面在于，在PCR之前,，DNA樣本在大量分區(qū)之間的平均分布,，無(wú)論是在微流控well還是在微油滴。然而,，當(dāng)使用大量基因組DNA時(shí),，高粘度可以影響平均分區(qū),。在這些情況下，制造商通常建議在分區(qū)步驟之前限制性消化DNA樣本,。然而,，這樣的反應(yīng)可能是費(fèi)時(shí)耗力的步驟，更不用說(shuō)限制性緩沖液還會(huì)負(fù)面地影響后續(xù)的PCR,。在4月份發(fā)表的一篇論文中個(gè),，Yukl等人表明，QIAshredder——含有一種生物聚合物（可降低粘度,，據(jù)報(bào)道可剪切DNA）的微型離心機(jī)旋轉(zhuǎn)柱,，可以代替限制性消化使用，來(lái)為液滴數(shù)字PCR（ddPCR）準(zhǔn)備基因組DNA,，從而在很寬范圍的輸入DNA數(shù)量測(cè)出更大的拷貝數(shù),。因?yàn)樗?jié)省時(shí)間和勞動(dòng)力，所以當(dāng)為ddPCR準(zhǔn)備大量基因組DNA時(shí),，QIAshredder可以被看作是限制性消化的一種不錯(cuò)的替代法,。
5、 在單一液滴數(shù)字PCR反應(yīng)中同時(shí)定量可變剪接轉(zhuǎn)錄本
數(shù)字PCR的一個(gè)應(yīng)用就是,，定量來(lái)自于一個(gè)基因的可變剪接mRNA的相對(duì)數(shù)量,。Yun-Ling Zheng及其同事們感興趣的是，檢測(cè)人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因產(chǎn)生的20個(gè)左右的剪接變體中的4個(gè)特定剪接變體,。這四個(gè)轉(zhuǎn)錄本不同之處在于,，它們是否包括α外顯子和/或β外顯子，因?yàn)樗鼈兂霈F(xiàn)在許多類型的腫瘤中,，因此是潛在的癌癥生物標(biāo)志物,。他們擔(dān)心，以前測(cè)定這4種剪接變體（α–/β+; α+/ β –; α–/ β –; α+/ β+）的qPCR試驗(yàn)不夠敏感,，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)水平較低,，作者決定轉(zhuǎn)而使用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）。在6月刊發(fā)表的論文中,，他們?cè)O(shè)計(jì)了一種方法,，在一個(gè)單一的ddPCR反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定α和β外顯子的有無(wú)，而不是用標(biāo)準(zhǔn)方法,，為每個(gè)樣本設(shè)置兩次ddPCR反應(yīng),，以測(cè)定每個(gè)外顯子。只使用一對(duì)PCR引物和兩種不同的雙標(biāo)記熒光水解探針,，Zheng的研究小組能夠在每個(gè)樣本的單次反應(yīng)中比較四種剪接異構(gòu)體的水平,。
在考慮2014年這五大BioTechniques PCR方法相關(guān)論文時(shí)，我們非常高興地發(fā)現(xiàn),，研究人員仍在繼續(xù)改善PCR的各個(gè)方面,，從基本的擴(kuò)增策略到技術(shù),，如數(shù)字PCR。我們希望這一令人鼓舞的趨勢(shì)在來(lái)年將會(huì)繼續(xù),。