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1、cell counting：盡量做到準(zhǔn)確,，會影響input結(jié)果,。

 

2、cross link：甲醛的終濃度是1%,，這個基本所有的protocol上都會強調(diào),。

 

3、resuspend cellswith SDS:一定要選用小的tip頭,，在液面下吹打,，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的sonication就麻煩了,。

 

4,、sonication：ChIP中zui重要的一部分，合適的條件要自己摸索,，可以一次嘗試不同次數(shù)的sonication,，然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。

 

5,、加入salmon spermDNA/Protein A or G之前要先混勻,，因為salmon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì),，若不混勻,，后面你會發(fā)現(xiàn)beads的量不一樣,，自然也會影響實驗的結(jié)果。

 

6,、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈,，但zui后一個要盡量吸干凈，必要時可用gel loading tips吸,。

 

7,、含beads的samples離心時，有的protocol上推薦是1000rpm,，45秒,，但可以根據(jù)情況調(diào)整，但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止beads破碎,。（當(dāng)然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個問題）

 

8,、reverse crosslink可以是65°4個小時，也可以overnight,。

 

9,、reverse crosslink后的在進行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來,。

 

10,、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準(zhǔn)確。

 

11,、1~10ul的槍取3ul以上才比較準(zhǔn)確,，所以考慮好自己PCR反應(yīng)體系的配置。

 

12,、一個ChIP一般需要3~4天的時間,，其中有幾個步驟是可以停下來的：

 

（1）細胞收集：用含蛋白酶抑制劑的PBS洗滌離心，去上清的細胞收集液可置-80°凍存,；

 

（2）用SDS重懸細胞后可置-80°凍存,；

 

（3）sonication結(jié)束，離心后的上清置新的離心管后可-80°凍存,；

 

（4）reverse cross-link后的標(biāo)本可-80°凍存,。

 

13、agarose beads 的wash過程中以及后面的DNA提取過程中乙醇的wash,，可以用細胞室的那種吸引器,，接上200ul的tip頭吸，這樣會節(jié)省很多時間（每個實驗室情況可能不一樣）,。

 

14,、DNA提取后建議用水溶解DNA，因為TE buffer里的EDTA可能會影響PCR反應(yīng)體系中的Mg2+,。

 

15,、溶解DNA的水量可以根據(jù)PCR反應(yīng)體系的要求適當(dāng)調(diào)整,。