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蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）知識(shí)匯總
閱讀：913 發(fā)布時(shí)間：2014-12-11蛋白Marker可分為：一,、未預(yù)染的Marker即寬分子 量蛋白標(biāo)準(zhǔn),、高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)以及低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);二、預(yù)染的Marker即單色預(yù)染和多色預(yù)染,。
在western blot 過(guò)程中,，分子量Marker就像個(gè)螺絲釘一樣沒(méi)雖然是個(gè)小細(xì)節(jié)，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用,。這個(gè) Western Blot參照家族的一員的作用主要是用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小,，只有標(biāo)準(zhǔn)量無(wú)誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說(shuō)服力,，除此之外,，蛋白標(biāo)準(zhǔn)還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一,。
總體來(lái)說(shuō),，蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)可以分成未染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)二個(gè)級(jí)別,。以下是關(guān)于蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的小敘：
一. 未染色(pre mixed)蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)
未染色的蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)是zui簡(jiǎn)單,，也是zui準(zhǔn)確的一種。由于沒(méi)有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子,，所示大小正好是蛋白原本的大小,，是判斷蛋白大小必須的。現(xiàn)在的Marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker,，方便不同大小的蛋白比較,。預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因?yàn)榛旌系臈l帶越多,，越不好記，誰(shuí)知道哪條是那條!數(shù)到眼都花了。所以當(dāng)看到特別濃的那幾條標(biāo)志帶就記得是哪里了,。不過(guò)要記得,，小帶通常都不那么容易看清楚的。在選擇上來(lái)說(shuō),，當(dāng)然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的,，越近越好。如果你的蛋白不幸在兩條跨度較大Marker條帶之間,，選別的Marker吧,。預(yù)混的Marker使用上不如預(yù)染Marker(pre-stained)好用，因?yàn)殡娪具^(guò)程中*看不到,，要和目標(biāo)蛋白一起等到zui后染色才“開(kāi)蠱”,，無(wú)法對(duì)實(shí)驗(yàn)起預(yù)示參照作用。*屬于“后知后覺(jué)”型的,，當(dāng)然還是比“不知不覺(jué)”不做對(duì)照的要好,。
① 寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
如果從實(shí)驗(yàn)室總體考慮的，就選范圍盡量寬,，條帶分布比較均勻的,，這樣你的蛋白無(wú)論在哪個(gè)區(qū)間都容易判斷，避免正好落在一段空白區(qū)的危險(xiǎn),。不過(guò)條帶越多,，每次上樣量也就越費(fèi)。拿到Marker后,，如果買(mǎi)的是大包裝,，就應(yīng)該考慮分裝。多次反復(fù)凍融對(duì)于蛋白的危險(xiǎn),，不用多說(shuō)吧,。另外要記得，寬譜的Marker不一定每條都能看到的,，特別是Mini Cell,。如果側(cè)重大蛋白，那小的可能就已經(jīng)跑掉了,，不是質(zhì)量不好哦,。
② 高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
通常在檢測(cè)大分子量蛋白經(jīng)常使用到高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，
③ 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
在一般的蛋白電泳當(dāng)中,，更常用的是低蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量,，除了有指示蛋白大小的作用以外，有時(shí)還可以用作粗略的定量,。實(shí)驗(yàn)室用在一般蛋白電泳的低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)中,。
在低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)這里還包括可特別小的蛋白標(biāo)準(zhǔn),，比如30kD以下蛋白或者多肽的分離辨別。其中GE的從2kD到16kD之間有6條帶的蛋白標(biāo)準(zhǔn)挺不錯(cuò),，另外提醒一句,，特別小的蛋白Marker條帶如果要顯色好，上樣一定要上足夠的量哦,。
二.預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)
預(yù)染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物,，通過(guò)與染料共價(jià)耦聯(lián)，在電泳過(guò)程中或者轉(zhuǎn)膜時(shí)可以直接觀察到,。預(yù)染蛋白分子量的出現(xiàn)方便了我們的實(shí)驗(yàn),，這種蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以幫助我們?cè)陔娪緯r(shí)、電泳后,，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測(cè)電泳情況和估計(jì)遷移率——比如,，已知垂直電泳*分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白進(jìn)入*分辨區(qū)時(shí)停止電泳以得到*分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時(shí)終止電泳;另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否*,，還可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量,，所以吸引了許多實(shí)驗(yàn)室人員購(gòu)買(mǎi)預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)。值得注意的是預(yù)染蛋白Marker與染料共價(jià)耦聯(lián),，所以在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生某些變化,，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合定位蛋白——不過(guò)多數(shù)情況下Marker的條帶未必能和我們的目標(biāo)蛋白*一樣,，我們得到的也不過(guò)是一種相對(duì)Marker指示的參考大小,，zui后都需要Western來(lái)定性，所以如果不是要區(qū)分大小相近的條帶,，預(yù)染Marker還是很好用的,，而且也可以和未染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。
預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以分為兩種：?jiǎn)紊A(yù)染和多色預(yù)染,，其實(shí)區(qū)別就在于幫助在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中辨認(rèn)某個(gè)條帶的大小——Marker條帶越多參考價(jià)值越大,，可就越難辨認(rèn)區(qū)分，如果用不同的顏色來(lái)區(qū)別就比較好辨認(rèn)啦,。如果沉悶的電泳實(shí)驗(yàn)中跑出五顏六色的彩虹Marker,，此時(shí)心情想必會(huì)愉快一些!單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來(lái)提示其大小的。還有一點(diǎn)特別要注意,，由于轉(zhuǎn)膜是一個(gè)將膠里的Marker濃縮在潔白的膜上,，所以需要的上樣量相對(duì)少一些，如果想要在電泳過(guò)程中看到美麗的“彩虹”,，或者單色的Marker往往需要比說(shuō)明書(shū)里多加一些Marker的,。
三、Western的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)
①生物素標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)
未染色的Marker在做Western時(shí),，需要在印跡前先用麗春紅或者是SYPRO熒光蛋白染色液等不干擾Western Blot的染色方法顯色,，在膠上做標(biāo)記zui后才能“拼”在zui后的結(jié)果中,，如果是預(yù)染的Marker就要在轉(zhuǎn)膜后標(biāo)記膜，或者剪膜,，zui后在“拼上”,。要是想直接將Marker結(jié)果顯示在zui后結(jié)果上，不用手工作圖或者拼接,，那就要Western的Marker了。比如生物素標(biāo)記的蛋白標(biāo)準(zhǔn),。這種方法主要是配合化學(xué)發(fā)光法：在蛋白分子量上標(biāo)記生物素,，通過(guò)帶有抗生物素的抗體或者偶聯(lián)鏈親霉素的抗體，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)到目的蛋白帶時(shí)就可以同時(shí)看到相應(yīng)的分子量標(biāo)準(zhǔn)一起發(fā)光顯影了,。不同于普通蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的便宜,、預(yù)染蛋白分子量的方便，這一方法的優(yōu)點(diǎn)是與Marker和目的蛋白對(duì)應(yīng)性好,，同時(shí)在同張片上顯示,，不用拼接，利于分析,。缺點(diǎn)是如果樣品中帶有生物素背景,，那個(gè)抗生物素抗體有可能影響結(jié)果,，而且反應(yīng)體系太過(guò)復(fù)雜也會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
②特殊標(biāo)記蛋白標(biāo)準(zhǔn)
在經(jīng)過(guò)修飾的蛋白標(biāo)準(zhǔn)中，除了生物素標(biāo)記以外,，近些年由于下游蛋白操作的豐富化與復(fù)雜化，也出現(xiàn)帶有“尾巴”的蛋白標(biāo)準(zhǔn),。比如His-Tag,，如果每個(gè)Marker條帶都有His –tag，那二抗添加His-Taq抗體很容易將Marker條帶顯示在Western結(jié)果上,。很方便,，問(wèn)題就是有可能有潛在的干擾，比如樣品中正好有類似Histag的結(jié)構(gòu),。不過(guò)這可以通過(guò)對(duì)照檢測(cè)的,。