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細胞外泌體分離的進展
閱讀：1640 發(fā)布時間：2024-12-16外泌體是細胞外膜囊泡的一種亞型,，直徑40 - 200nm,，由細胞分泌到周圍環(huán)境中。外泌體作為一種天然藥物可用于治療多種疾病,。例如,，許多研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與了許多生理和病理過程，如癌癥,、炎癥和動脈粥樣硬化,。外泌體廣泛的藥理邏輯作用是由于功能分子的裝載，如蛋白質,、DNA,、脂質和RNA，它們具有調節(jié)作用,，它們攜帶和轉移,，在調節(jié)多種疾病過程(如腫瘤生長、轉移和血管發(fā)生)中起著至關重要的作用,，可以用作預后標記物,，例如，作為癌癥患者的分級基礎,。此外,，外泌體含有各種抗凋亡、抗炎和抗氧化成分,，在治療各種疾病方面具有相當大的前景,。
外泌體提取和外泌體純化
外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲,、沉淀或過濾幾種方法,，這些方法僅適用于前期研究,，對于后期工藝放大難以滿足，限制了規(guī)?；a藥品級外泌體治療產品供臨床使用,。致使有效的外泌體提取和外泌體純化工藝技術成為外泌體治療市場的一個關鍵技術阻礙。
外泌體純化的對比
鑒于外泌體的多種功能和再生潛力,，獲得高產量,、高純度和高質量的外泌體至關重要。目前,，許多外泌體的分離技術都是基于它們的生物物理和/或生化特征,，如大小、密度和特定表面標記而開發(fā)的,。但是,，由于要求的不同和生物流體的復雜性,，必須仔細考慮分離技術的選擇,。
超速離心技術的應用
1、 超離心（UC）使用100,000 g的離心力來有效地分離小顆粒,，如病毒,、細菌和細胞器UC根據其主要作用機制大致可分為三類：差速離心(DC)、等密度梯度離心和速率帶離心(RZC),。UC一直被認為是外泌體隔離的“黃金標準",。然而，每種生物流體的復雜性,、特定組成和物理性質構成了獲得可復制的純外泌體制劑的技術障礙,。
a、差速離心這項技術依賴于通過沉降沉淀法對顆粒進行順序分離,，這取決于顆粒的大小和密度,，通過使用一系列離心力和持續(xù)時間。DC通過300至100,000 g的離心力進行多次離心循環(huán),，通過控制不同的離心力和離心次數(shù),，依次去除細胞、細胞碎片和凋亡小體,。最后一次離心(即100,000 g)后,，通過去除上清來收集外泌體。然而,，差速離心法有一些局限性,，例如耗時，需要昂貴的設備,，操作繁瑣,，并且在過高的轉速下破壞外泌體的完整性。此外，一些脂蛋白可以與外泌體共沉淀因此,，我們提出了密度梯度離心法來提高外泌體的純度,。
b、使用兩種類型的密度梯度超離心：等重超離心和RZC,。DC經常遭受污染和外泌體損失,，因為外泌體的不均勻性和細胞外囊泡大小有相當大的重疊。UC通常與等滲或RZC技術相結合,，以允許相對低密度的外泌體懸浮以進一步凈化,。該技術還可以提高外泌體的分離量。典型的密度梯度UC包括以下步驟:首先,，將覆蓋樣品顆粒密度范圍的具有不同密度的生物相容性介質層(例如,，碘二醇或蔗糖)放入管中，從底部到頂部密度逐漸降低,。然后將感興趣的樣品添加到密度梯度介質的頂部,，然后延長離心時間(例如，100,000 g離心16小時),。與普通UC相比,，密度梯度離心可有效提高外泌體的純度，例如,，用密度梯度離心法從豬骨髓中分離骨髓細胞然而,，蔗糖-密度梯度UC分離過程耗時長，需要大量的生物樣品,，回收率較低,。Kuipers等人發(fā)現(xiàn)，對于小密度梯度的離心過程,，碘沙醇比蔗糖更適合使用,，因為在碘沙醇梯度中，外泌體可以以相對更快的速度達到平衡,。因此,，可以通過選擇合適的惰性介質來優(yōu)化外泌體的分離，從而提高分離效果,。
基于大小的分離方法
1. 超濾UF是一種基于物質大小的分離方法,，利用具有不同分子量截止點(MWCO)的膜分離外泌體，通常與其他方法聯(lián)合使用進行進一步純化,。與UC相比,，UF增加了囊泡隔離，顯著縮短了處理時間,，提高了吞吐量,，但不需要特殊設備,。但由于剪切力的作用，UF容易發(fā)生開裂和變形,，造成外泌體的損失,。
基于超濾原理，導出了切向流過濾和順序過濾方法,。在TFF模式下,，樣品流體沿平行于膜的方向進入，調節(jié)了膜間壓力,，減少了外泌體的損失和膜的堵塞,，延長了膜的使用壽命。TFF在吞吐量,、再現(xiàn)性,、時間、成本和可擴展性方面都超過了UC,。
2.順序過濾是另一種常用的方法,，其中樣品首先通過1000 nm的過濾器去除細胞碎片和凋亡囊泡，然后通過500-kD MWCO的第二個過濾器去除TFF中的游離蛋白,。最后,，50 - 200nm直徑的材料可以通過200nm的過濾器進行隔離,。該方法具有溫和,、自動化、適合大顆粒的優(yōu)點,，可用于生產尺寸均勻的外泌體,，在很大程度上保證了外泌體的完整性和純度。
為了克服傳統(tǒng)過濾的局限性,，Chernyshev等人開發(fā)了不對稱深度過濾(DF),，作為一種容易獲得的方法，具有高收率和低外泌體污染,。常規(guī)過濾一般分為表面過濾和DF過濾,。
在表面過濾過程中，大顆粒由于其尺寸而被保留,，這些顆粒最終會在過濾介質表面形成一個“餅",，而對于DF介質，大空隙允許顆粒進入介質的孔隙,。因此,，不對稱DF方法的原理是，當外泌體固定在多孔介質表面和深度內時,，小顆?？梢员幌疵?。該方法適用于從用于培養(yǎng)ev分泌細胞的大量培養(yǎng)基中分離治療性外泌體。
切向流過濾系統(tǒng)
TunerSystems外泌體純化系統(tǒng) 是一款研發(fā)型自動化過濾系統(tǒng),，理想的生物工藝開發(fā)研發(fā)階段自動化切向流過濾系統(tǒng),，適合處理小體積的料液微濾和超濾，最高可處理量15L,，循環(huán)體積可低至10mL,。
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