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技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在

 

聚合酶鏈式反應(yīng)

實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不僅操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床,。

工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火（復(fù)性）--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時

  

聚合酶鏈式反應(yīng)

間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準備,；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右,，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。

工作步驟

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火（復(fù)性）（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈。

3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右*的活性）的作用下,，以dNTP為原料,，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈,。

每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸，DNA含量既增加一倍,。如圖所示：

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,，以減少一次升降溫過程,，提高了反應(yīng)速度。