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PCR工作原理及步驟
閱讀：1798 發(fā)布時間：2011-5-16技術原理
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。在
聚合酶鏈式反應
實驗中發(fā)現,，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復性,，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復制,。
但是，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本,，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床,。
工作原理
類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火（復性）--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時
聚合酶鏈式反應
間后,，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結合,，為下輪反應作準備,；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右,，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
工作步驟
標準的PCR過程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA
2.退火（復性）（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合,，形成局部雙鏈,。
3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右*的活性）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的5′端→3′ 端延伸,，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經過變性,、退火和延伸,，DNA含量既增加一倍。如圖所示：
現在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是*也能在很短的時間內復制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,，以減少一次升降溫過程,，提高了反應速度。