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凋亡如何測(cè),？流式圖看不懂？簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單教你讀懂凋亡流式圖?。,。?！做個(gè)流式小能手~~

Section.01

什么是凋亡,？

細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)，或者說(shuō)是程序性細(xì)胞死亡,，是細(xì)胞遵循自身基因指令進(jìn)行的一種有條不紊的自我毀滅過(guò)程,。這個(gè)過(guò)程在生物體的正常發(fā)育和維持健康狀態(tài)中扮演著重要角色，并且在一些疾病狀態(tài)下也會(huì)發(fā)生[1],。

細(xì)胞凋亡會(huì)產(chǎn)生什么樣的變化呢,？

早期階段，你會(huì)看到細(xì)胞開(kāi)始皺縮變小,，細(xì)胞核會(huì)破裂成碎片,，同時(shí)細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)一些泡泡狀的小突起，最終這些突起會(huì)分離出來(lái),，形成含有細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的小包,，我們稱之為“凋亡小體"。有趣的是,，盡管細(xì)胞正在分解,，但它的外層膜仍然保持完整，確保了細(xì)胞內(nèi)容物不會(huì)隨意泄漏出去,。

圖 1. 細(xì)胞凋亡過(guò)程,。

除此之外，細(xì)胞內(nèi)部還會(huì)發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng),，例如激活特定的酶 (Caspase),，這些酶會(huì)進(jìn)一步切割其他蛋白質(zhì)，像 PARP 這樣的底物,。還有,，線粒體中的細(xì)胞色素 c 會(huì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，DNA 會(huì)被切割成小片段,。細(xì)胞膜也會(huì)發(fā)生變化,，比如位于膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 會(huì)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，同時(shí)線粒體膜電位也會(huì)改變,。最后,，調(diào)控細(xì)胞生死命運(yùn)的蛋白家族成員，如 Bax,、Bid,、Bcl-2 等，它們的表達(dá)量也會(huì)有所調(diào)整,，以促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程[1][2][3],。

Section.02

如何檢測(cè)凋亡呢？

那怎么檢測(cè)細(xì)胞凋亡呢,？我們?cè)谶@介紹了兩種流式檢測(cè)方法,，如果你感興趣的話讓我們一起看下去吧~

首先，最-常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法是 Annexin V/PI 雙染法,。

Annexin V 是一種依賴鈣離子的蛋白質(zhì),，能特異性地綁定到細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸 (PS)。在健康細(xì)胞中,，PS 位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),；而在凋亡早期，PS 會(huì)移到外側(cè),。因此,，用熒光標(biāo)記 (如 FITC) 的 Annexin V 可以檢測(cè)到這個(gè)變化，表明細(xì)胞開(kāi)始凋亡,。

PI (碘化丙啶) 是一種紅色熒光染料,，它不能進(jìn)入活細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞，但可以進(jìn)入已經(jīng)死亡或晚期凋亡細(xì)胞,，因?yàn)檫@些細(xì)胞的膜已經(jīng)破損,。

所以，通過(guò) Annexin V 和 PI 的結(jié)合使用,，我們可以區(qū)分早期凋亡,、晚期凋亡和壞死的細(xì)胞,。這種方法可以通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡輕松完成檢測(cè)。

其次,，我們還可以檢測(cè)線粒體跨膜電位 (?ΨM),，在具有較高 ?ΨM 的健康細(xì)胞中，JC-1 染料可進(jìn)入細(xì)胞并在線粒體中積累,，形成 J-aggregates 發(fā)出橙紅色熒光,。在凋亡細(xì)胞中，?ΨM 較低,，JC-1 染料進(jìn)入線粒體較少,，以單體形式存在發(fā)出綠色熒光。

Section.03

案例: Annexin V/PI 法檢測(cè)

接下來(lái),，讓我們一起來(lái)看看 Annexin V/PI 法檢測(cè)實(shí)戰(zhàn)吧,！

案例一

為了探究敲低 MUC16 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系 C666-1 和 HK-1 的糖酵解以及免疫逃逸能力的影響，作者利用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒 (HY-K1073) 評(píng)估了鼻咽癌細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的凋亡情況[4],。

圖 2. 流式細(xì)胞術(shù)顯示 C666-1 和 HK-1 細(xì)胞中 MUC-16 的缺失誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡[4],。

a. 活細(xì)胞中，不可檢測(cè)到 Annexin V-FITC/PI 的熒光,。因?yàn)榛罴?xì)胞的細(xì)胞膜完整,，不結(jié)合 Annexin V-FITC，PI 也無(wú)法穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,，不發(fā)光,。

b. 早期凋亡細(xì)胞中，可以檢測(cè)到 Annexin V-FITC 的熒光,，但不可檢測(cè)到 PI 的熒光,。因?yàn)榧?xì)胞膜磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻，Annexin V 可以結(jié)合,，但細(xì)胞膜完整,，PI 無(wú)法穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，顯示出綠色熒光,。

c. 晚期凋亡細(xì)胞中,，均可以檢測(cè)到 Annexin V-FITC/PI 的熒光。因?yàn)榧?xì)胞膜的完整性被破壞,，Annexin V-FITC/PI 都可以進(jìn)入細(xì)胞,，顯示出綠色和紅色熒光。

d. 流式圖的縱坐標(biāo)是 PI,，在左上 (Q1-UL) 區(qū)域,，發(fā)出紅色熒光，紅色熒光越強(qiáng),，表示細(xì)胞死亡越嚴(yán)重,。流式圖的橫坐標(biāo)是 Annexin V-FITC,，在右下 (Q1-LR) 區(qū)域發(fā)出綠色熒光，綠色熒光越強(qiáng),，表示早期凋亡細(xì)胞越多,。左下 (Q1-LL) 是正常細(xì)胞，不發(fā)光,。右上 (Q1-UR) 是晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，發(fā)出綠色和紅色兩種熒光,。

案例二

為了評(píng)估不同濃度的 1,25(OH)2D3 對(duì)頭腎巨噬細(xì)胞 (HKMs) 細(xì)胞活力的影響,，作者利用 Annexin V-iFluor 488/PI (HY-K1080) 檢測(cè)細(xì)胞凋亡[5]。

圖 3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 1,25-(OH)2D3 對(duì) HKMs 細(xì)胞凋亡的影響[5],。

a. 1,25(OH)2D3 未處理組活細(xì)胞百分比為 24.8%,。

b. 1 nM 處理組肝細(xì)胞百分比為 36.1%。

c. 10 nM 處理組活細(xì)胞百分比為 56.3%,。

d. 100 nM 處理組活細(xì)胞百分比為 40.8%,。

e. 流式圖的橫坐標(biāo)是 FL1-H (FITC-H) 代表 Annexin V-iFluor 488 的熒光強(qiáng)度。Annexin V-iFluor 488 用于檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞,。流式圖縱坐標(biāo)是 SSC-H (SSC-H) 代表側(cè)向散射光強(qiáng)度,，用于檢測(cè)細(xì)胞的顆粒性和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，側(cè)向散射光強(qiáng)度通常與細(xì)胞內(nèi)顆粒物的大小和數(shù)量有關(guān),。

f. 低側(cè)向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 熒光強(qiáng)度 (FL1-H),。通常代表活細(xì)胞。高側(cè)向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 熒光強(qiáng)度 (FL1-H),。通常代表細(xì)胞凋亡晚期或壞死細(xì)胞,。高側(cè)向散射 (SSC-H) 和低 Annexin V-iFluor 488 熒光強(qiáng)度 (FL1-H)。通常代表細(xì)胞凋亡早期,。低側(cè)向散射 (SSC-H) 和高 Annexin V-iFluor 488 熒光強(qiáng)度 (FL1-H),。通常代表細(xì)胞凋亡早期。

Annexin V/PI 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)

(以 HY-K1073 為例)

1． 細(xì)胞與 Annexin V-FITC 和 PI 孵育

1.1 收集細(xì)胞：收集 1-5 × 105 個(gè)細(xì)胞,。

• 懸浮細(xì)胞：1000 g 離心 5 min,，棄去上清。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 輕輕重懸細(xì)胞沉淀,，1000 g 離心 5 min,，棄去上清，保留細(xì)胞沉淀,。

• 貼壁細(xì)胞：小心吸取細(xì)胞培養(yǎng)液保存?zhèn)溆?。加?PBS 洗滌后，加入適量胰酶消化液 (盡量不含 EDTA,，以免影響 Annexin V 和 PS 的結(jié)合) 消化細(xì)胞,。加入前面收集的培養(yǎng)液,，輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液,，1000 g 離心 5 min,，棄去上清。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 輕輕重懸細(xì)胞沉淀,，1000 g 離心 5 min,，棄去上清，保留細(xì)胞沉淀,。注：建議胰酶消化液不含 EDTA,。

2. 加入 195 μL Binding Buffer，輕輕重懸細(xì)胞,。

3. 加入 5 μL Annexin V-FITC,，輕輕混勻。

4. 加入 10 μL PI Stain,，輕輕混勻,。

5. 室溫下避光孵育 10-20 min。

注：孵育過(guò)程中可輕輕顛倒數(shù)次以加強(qiáng)染色效果,。

6. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,。

01

注意事項(xiàng)

a. 流式檢測(cè)時(shí)，Annexin V-FITC 最大激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm,，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 525 nm,，在 FL1 通道檢測(cè)；PI-DNA 最大激發(fā)波長(zhǎng)為 535 nm,，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 617 nm,，在 FL2 或FL3 通道檢測(cè)。

b. 建議設(shè)置三組對(duì)照：未染色組,、PI 單染組及 Annexin V-FITC 單染組,。

c. 所有操作應(yīng)盡量快速，避免細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于非生理?xiàng)l件下,。

d. 染色后的樣本需盡快分析,，以防止染料信號(hào)減弱影響結(jié)果準(zhǔn)確性。

Section.04

案例:

JC-1 法檢測(cè)線粒體跨膜電位

那么 JC-1 法檢測(cè)線粒體跨膜電位是怎么做的呢,？一個(gè)案例帶你讀懂 JC-1 法,！

文獻(xiàn)中為了檢測(cè)人參皂苷 Rd 在高糖條件下對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響，利用 JC-1 (HY-15534) 檢測(cè)線粒體膜電位變化[6],。

圖 4. 流式細(xì)胞術(shù)顯示人參皂苷 Rd 和 NAC 對(duì)高糖誘導(dǎo)的線粒體功能障礙具有保護(hù)作用[6],。

a. 高糖處理 (HG) 導(dǎo)致線粒體膜電位下降，表現(xiàn)為綠色熒光增加。

b. 人參皂苷 Rd 和 NAC 均能部分或完-全恢復(fù)高糖處理導(dǎo)致的線粒體膜電位下降,，表現(xiàn)為綠色熒光減少,，紅色熒光增加。

c. 人參皂苷 Rd 的效果隨著濃度的增加而增強(qiáng),。

實(shí)驗(yàn)步驟與注意事項(xiàng)

一,、JC-1 染色液的配制

• 制備儲(chǔ)存液

用 DMSO 配制 5 mg/mL 的 JC-1。如用 1 mL DMSO 溶解 5 mg JC-1,。

注意：1) JC-1 儲(chǔ)存液建議分裝后于 -20℃ 或 -80℃ 避光保存,。

• 工作液的配制

用預(yù)熱好的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)存液，配制成 1-20 μg/mL 的 JC-1 工作,。

注意：

1) 請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整 JC-1 工作液濃度,，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

2) 如果 JC-1 進(jìn)入細(xì)胞的效果不好,，可向工作也液中加入適量 20% Pluronic F127 溶液，終濃度為 0.02-0.05%,，Pluronic F127 可以防止 JC-1 在緩沖液中聚合并幫助其進(jìn)入細(xì)胞,。

二、JC-1 染色

1. 以 6 孔板為例進(jìn)行細(xì)胞鋪板,，密度為 5×105 cells/mL,。37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜,。

注意：進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度建議不超過(guò) 1×106/mL,，也可根據(jù)自己的細(xì)胞類型培養(yǎng)至合適的密度。

2. 取 0.5 mL 細(xì)胞懸液至無(wú)菌的離心管內(nèi),。

3. 400 g 離心 3-5 min,；棄上清。

4. 用 1 mL JC-1 工作液重懸細(xì)胞,，于 37℃,，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育 15-30 min。

5. 室溫條件 400 g 離心 5 min,；吸掉上清,。

6. 用 2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞，之后室溫條件 400 g 離心 5 min,；棄上清,，重復(fù)兩次。

7. 用 1 mL 新鮮培養(yǎng)液或者緩沖液重懸細(xì)胞,，立刻進(jìn)行后續(xù)的流式分析或熒光顯微鏡觀察,。

8. 數(shù)據(jù)分析 (流式細(xì)胞儀)：含有紅色 JC-1 聚集物的健康細(xì)胞線粒體用 FL2 通道檢測(cè)；含有綠色 JC-1 單體的凋亡或不健康細(xì)胞用 FL1 (FITC) 通道檢測(cè)。

Section.05

小結(jié)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,，你學(xué)會(huì)了嗎,？如果你覺(jué)得這篇干貨滿滿的凋亡檢測(cè)方法有幫助，記得動(dòng)動(dòng)小手點(diǎn)贊收藏哦?。,。∥覀兿缕谝?jiàn),，為大家?guī)?lái)更多的科研小干貨~

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[1] Susan Elmore, et al. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007 Jun;35(4):495-516.

[2] Rebecca C Taylor, et al. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Mar;9(3):231-41.

[3] Anna Chmurska, et al. Two Faces of Autophagy in the Struggle against Cancer. Int J Mol Sci. 2021 Mar 15;22(6):2981.

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[5] Fengxia Zhao, et al. Oral administration of high-dose vitamin D3 can effectively suppress Nocardia seriolae infection in largemouth bass (Micropterus salmoides). Aquaculture. Volume 595, Part 2, 30 January 2025, 741643.

[6] Kai Tang, et al. Ginsenoside Rd ameliorates high glucose-induced retinal endothelial injury through AMPK-STRT1 interdependence. Pharmacol Res. 2022 May:179:106123.