阿爾茨海默癥 (AD) 屬于老年癡呆癥的一種,，是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,，其機(jī)制主要涉及 β-淀粉樣蛋白斑塊 (Amyloid-β, Aβ) 等。本期小 M 給大家介紹幾種針對(duì) Aβ 的生物檢測方法,！
Section.01
Aβ 的常見生物檢測方法
針對(duì) Aβ 檢測的生物實(shí)驗(yàn)方法有多種,，從 ELISA 和 Western Blot 的精準(zhǔn)定量，到質(zhì)譜分析的高分辨率檢測,，再到 IHC 的組織分布觀察,，這些技術(shù)揭示關(guān)鍵蛋白 Aβ 的奧秘，助力 AD 研究!
Section.02
酶聯(lián)免疫吸附測定
研究表明,，AD 患者腦脊液 (CSF) 的 Aβ42 水平的變化一般發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)前的 10-20 年，而血液中與 AD 相關(guān)的生物標(biāo)志物豐度非常低，因此需要超靈敏的檢測技術(shù)來量化 Aβ42 水平,。通過 酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 和其他常規(guī)免疫測定法測定顯示,，AD 患者 CSF 中的 Aβ42 濃度降低，這可能與大腦中的血腦屏障和清除系統(tǒng)有關(guān),。而利用免疫磁還原 (IMR) 技術(shù)檢測顯示 AD 早期患者血液 Aβ42 水平升高,，特別是 AD 引起的輕度認(rèn)知障礙 (圖 1)[1]。
圖 1. 對(duì)照組 (CONT) 和 AD 組血漿 Aβ42 和 CSF Aβ42 水平呈負(fù)相關(guān)[1],。
ELISA 基本原理：將一定濃度的抗原或抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待測樣本,，通過酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被測抗原或者抗體是否存在或量的多少,。
IMR 基本原理：利用分散在水中之披覆有抗原或抗體的磁性粒子與待測生物分子結(jié)合后，形成磁性粒子叢集或造成磁性粒子變大變重,，再量測因這些磁性粒子叢集或大磁性粒子的形成而改變試劑磁性大小,，從而檢測出待測生物分子濃度的新穎檢測方式。
Section.03
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
Aβ 寡聚體是在 Aβ 聚集過程中早期的致病分子形式和神經(jīng)毒性物質(zhì),。由于 Aβ 寡聚體異質(zhì)且瞬時(shí)存在,，光誘導(dǎo)未修飾蛋白質(zhì)交聯(lián) (PICUP) 反應(yīng)可有效的交聯(lián)得到 Aβ40/Aβ42 寡聚物，再通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 量化其相對(duì)豐度,。Aβ40 主要通過二聚體至四聚體進(jìn)行寡聚化,，而 Aβ42 主要通過五聚體和六聚體進(jìn)行寡聚化[2][3]，且隨著寡聚體增加而表現(xiàn)出強(qiáng)度降低 (圖 2a),。鑒于 SDS 影響 Aβ 的寡聚化狀態(tài),，電噴霧電離質(zhì)譜法 (ESI-IM-MS) 進(jìn)一步準(zhǔn)確表征低豐度 Aβ 寡聚體的分布 (圖 2b)[4]。
圖 2. Aβ42 主要通過五聚體和六聚體進(jìn)行寡聚化[4],。
a. 通過 SDS-PAGE 分析表征 LMW 和 LMW_CL Aβ40 和 Aβ42 低聚物分布。b. LMW Aβ42 的 ESI-IM-MS 譜圖 ,。(M = 單體,，D = 二聚體，Tr = 三聚體,，Te = 四聚體,，P = 五聚體，Hex/Hx = 六聚體,。)
PICUP基本原理：利用光能作為催化劑,，驅(qū)動(dòng)特定的化學(xué)反應(yīng)，從而在無需修飾蛋白質(zhì)的情況下實(shí)現(xiàn)交聯(lián),。
SDS-PAGE基本原理：在 SDS-PAGE 中,，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）和強(qiáng)還原劑，SDS 破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，使其構(gòu)象改變,，而還原劑打開蛋白質(zhì)內(nèi)的二硫鍵,，使其分解為亞基。根據(jù)待測樣品中蛋白質(zhì)分子量大小的不同,，使其在電泳膠中分離,。
ESI-IM-MS基本原理：在毛細(xì)管的出口處施加高電壓，產(chǎn)生的高電場將從毛細(xì)管流出的液體霧化成微小的帶電液滴,。隨著溶劑的蒸發(fā),，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增加，最后液滴分裂成一個(gè)或多個(gè)帶電離子,，從而使分析物以單電荷或多電荷的形式進(jìn)入氣相變成氣相離子,，再檢測產(chǎn)生高電荷離子的質(zhì)量電荷比。
Section.04
免疫組化
AD 的主要特征是老年斑 (SP) 和 神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFT) 在脆弱的大腦區(qū)域沉積,。SP 在神經(jīng)元內(nèi)積累,，由聚集的 Aβ40/42 肽組成。用 Aβ42 的 C 端特異性抗體對(duì)認(rèn)知障礙受試者中的腦組織染色,，可以清晰的看到 AD 患者早期腦部組織顯示出大量的區(qū)域特異性神經(jīng)元內(nèi)免疫反應(yīng)性,，尤其在海馬/內(nèi)嗅皮層等區(qū)域的錐體神經(jīng)元中 (圖 3)[5],。
圖 3. Aβ42 在 AD 患者早期腦部組織中積累[5]。
a. 神經(jīng)學(xué)正常的 3 歲患者（對(duì)照）海馬體 CA4 區(qū)域的 Aβ42 染色;只能看到微弱的神經(jīng)元染色,。b. 一名患有唐氏綜合征的 3 歲兒童的明顯 CA4 Aβ42 免疫反應(yīng)性,。c. 79 歲無癡呆患者的 Aβ42 染色 表明內(nèi)嗅皮層的 II 層神經(jīng)元（箭頭）有明顯的 Aβ42 細(xì)胞內(nèi)染色。d. 83 歲的認(rèn)知障礙受試者中,，在 Aβ42 (RU) 染色的神經(jīng)元中明顯缺乏核內(nèi) Aβ42 染色; e. 72 歲的晚期 AD 受試者的“神經(jīng)元"形狀的老年斑 (SP)（箭頭）與更傳統(tǒng)的球形 SP 相鄰,；f. 79 歲認(rèn)知障礙受試者的 CA1 區(qū)域顯示神經(jīng)元內(nèi) Aβ42 免疫反應(yīng)性和明顯的神經(jīng)元外彌漫性斑塊樣染色 (箭頭)。
IHC 基本原理：融合免疫學(xué)原理 (抗原抗體特異性結(jié)合) 和組織學(xué)技術(shù) (組織的取材,、固定,、包埋、切片,、脫蠟,、水化等)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素,、酶,、金屬離子、同位素) 顯色,，來對(duì)組織 (細(xì)胞) 內(nèi)抗原進(jìn)行定位,、定性及定量的研究 (主要是定位)。
Section.05
質(zhì)譜分析
Aβ40 在 AD 患者體內(nèi)的豐度是 Aβ42 的 10 倍，但 Aβ42 的神經(jīng)毒性比 Aβ40 強(qiáng),。用納米 ESI 離子遷移質(zhì)譜儀檢測 Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物（用 FMOC 化學(xué)方法合成 Aβ40 和 Aβ42）發(fā)現(xiàn),，純 Aβ42 的寡聚化速度比 Aβ40 快得多，導(dǎo)致 Aβ42 快速耗盡 (圖 4a)[6],。CSF 中 Aβ42 與 Aβ40 的比率有助于評(píng)估 AD,，但定量受到包括分析前分析物損失等因素的限制。高通量 LCMS/MS 技術(shù)可以限制分析物損失,，對(duì)臨床的 CSF 標(biāo)本分析顯示 AD 和輕度認(rèn)知障礙 (MCI) 患者中 Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度都降低[15],，進(jìn)一步證實(shí) Aβ42 的寡聚化是 AD 的重要原因 (圖 4b)。
圖 4. Aβ42/Aβ40 比值和 Aβ42 濃度在 AD 和 MCI 患者中都降低[7]。
a. Aβ40 和 Aβ42 的 1：1 混合物的負(fù)離子質(zhì)譜[14],。b. Aβ42/Aβ40（上）和 Aβ42（下）在 AD,、MCI、DLB/AD,、健康對(duì)照,、非 AD 癡呆和伴或不伴 AD 的 DLB 中的分布 (MCI：輕度認(rèn)知障礙；DLB：路易體癡呆),。
LCMS/MS 基本原理：樣品通過液相色譜分離后的各個(gè)組分依次進(jìn)入質(zhì)譜檢測器,，各組分在離子源被電離，產(chǎn)生帶有一定電荷,、 質(zhì)量數(shù)不同的離子,。不同離子在電磁場中的運(yùn)動(dòng)行為不同，采用質(zhì)量分析器按不同質(zhì)荷比（m/z）把離子分開,，得到依質(zhì)荷比順序排列的質(zhì)譜圖,。
Section.06
免疫熒光
神經(jīng)元內(nèi) Aβ42 在 AD 或 DS 切片中具有胞質(zhì)顆粒免疫反應(yīng)性[8]，主要定位于神經(jīng)元的突觸前,，尤其是突觸后隔室內(nèi)的多泡體中積累,，但由于很快被大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞清除，因此不容易觀察到,。在唐氏綜合癥 (DS) 星形膠質(zhì)細(xì)胞中使用針對(duì) Aβ42 C 端產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行了免疫熒光顯微鏡觀察,，顯示 DS 星形膠質(zhì)細(xì)胞中 Aβ42 呈囊泡狀分布 (圖 5a)[9]。細(xì)胞內(nèi) Aβ42 能直接激活 p53 啟動(dòng)子,，導(dǎo)致 p53 依賴性細(xì)胞凋亡,。此外，氧化 DNA 損傷誘導(dǎo)了豚鼠原代神經(jīng)元中 Aβ42 的核定位和 p53 mRNA 升高,。氧化 DNA 損傷可能誘導(dǎo) Aβ42 在胞質(zhì)溶膠中積累,，然后依次在激活 p53 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞核中積累 (圖 5b) [10],。
圖 5. Aβ42 呈囊泡狀分布,，且氧化 DNA 損傷誘導(dǎo)了 Aβ42 的核定位[9][10],。
a. 正常 (NL) 和 DS 星形膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì) Aβ42 進(jìn)行免疫熒光檢測 (上)[9]。b. H2O2 誘導(dǎo)胚胎豚鼠腦細(xì)胞中 Aβ42 (綠色) 和 p53 (紅色) 的雙重免疫染色 (下)[10],。
IF 基本原理：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原 (或抗體),。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的組織,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及定量 (熒光面積或平均熒光強(qiáng)度等),。
Section.07
流式細(xì)胞術(shù)
Aβ 肽的異常神經(jīng)元積累會(huì)影響突觸傳遞并導(dǎo)致 AD 大腦的神經(jīng)退化,。其中 Aβ40 和 Aβ42 能擾亂神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。利用分析流式細(xì)胞術(shù)用 Aβ42 特異性抗體檢測 AD 患者額葉皮層和紋狀體中發(fā)生的突觸變化,，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重 AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽性突觸體的數(shù)量增加,，并在人皮質(zhì)突觸體中積累 (圖 6a-c)[11]。此外,，Aβ40 通過減少 PC12 細(xì)胞對(duì) F-Aβ42 (熒光素標(biāo)記的 Aβ42) 的攝取來減少 Aβ42 在神經(jīng)元內(nèi)積累和溶酶體定位 (圖 6d-f)[12],。
圖 6. AD 患者大腦皮層中 Aβ42 陽性突觸體的數(shù)量增加[11][12],。
(a-c) 用抗 Aβ42 抗體檢測 AD 患者皮質(zhì)突觸體中 NFT 分布的 Braak 階段系統(tǒng)，神經(jīng)炎斑塊密度的 CERAD 評(píng)分和 Aβ42 斑塊分布的 Thal 期[11],。（d）Aβ40 抑制分化的 PC12 細(xì)胞中對(duì) F-Aβ42 的攝取細(xì)胞內(nèi)熒光的流式細(xì)胞術(shù)直方圖顯示 Aβ40 預(yù)處理細(xì)胞中 F-Aβ42 攝取的抑制,；（e）F-Aβ40 的攝取不受 Aβ42 預(yù)處理細(xì)胞的影響,。（f）細(xì)胞內(nèi)熒光的幾何平均值[12],。
FC基本原理：利用激光激發(fā)帶有熒光標(biāo)記的微粒，檢測其散射光信號(hào)和熒光信號(hào),，從而反應(yīng)微粒的各個(gè)參數(shù),，并將特定性狀的微粒分選出來。
Section.08
表面等離子體共振
在正常生理?xiàng)l件下,， Aβ42 和 Aβ40 肽以 1:9 的比例共存于大腦中,。而在家族性 AD 患者的大腦中，該比率通常轉(zhuǎn)變?yōu)?Aβ42 的較高百分比,，導(dǎo)致突觸毒性增加,。據(jù)報(bào)道，盡管這兩種肽的化學(xué)性質(zhì)非常相似,， Aβ42:Aβ40 比率的微小變化會(huì)極大地影響神經(jīng)毒性寡聚體的形成,。利用 SPR 技術(shù)表征了不同生物素化的 Aβ42:Aβ40 比率的開始和結(jié)束狀態(tài),，并證實(shí)了 Aβ42 和 Aβ40 可以直接相互作用，并且它們相互影響各自的聚集行為 (圖 7)[13],。
圖 7. Aβ42 和 Aβ40 直接相互作用[13]。
SPR 基本原理：指金屬表面的電子以及周圍介質(zhì)中的電子,，以特殊頻率的共振而產(chǎn)生的一種特殊的電磁波,，可以檢測抗原與抗體、DNA 與蛋白,、蛋白與蛋白之間的相互作用,。
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